真鯛肌肉中蛋白酶及其抑制劑的研究.pdf

1、蛋白酶及其內(nèi)源性抑制劑在細(xì)胞和生物體的生命活動過程中起著十分重要的作用，在生產(chǎn)實(shí)踐中也具有廣泛的用途。魚類作為動物中最豐富的物種之一，為人類提供優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源。魚類肌肉蛋白代謝和死后儲藏過程中的降解等生化變化與其內(nèi)源性蛋白酶和抑制劑密切相關(guān)，而這些變化又直接影響魚肉的品質(zhì)。因此，對魚類蛋白及其內(nèi)源性抑制劑的研究具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。本文以海水魚真鯛為研究對象，對其肌肉中三種蛋白酶和一種內(nèi)源性蛋白酶抑制劑進(jìn)行了研究，為闡明魚

2、類肌肉蛋白新陳代謝機(jī)制、魚死后肌肉軟化機(jī)理等提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論參考。 通過硫酸銨沉淀、DEAE-Sephacet離子交換層析、Sephacryl S-200凝膠過濾、羥基磷灰石層析和Phenyl-Sepharose疏水層析等5步純化，首次從海水名貴魚真鯛肌肉中純化到一種亮氨酸氨肽酶(LAP)。LAP是一種結(jié)合Zn2+和(或)Mn2+的金屬蛋白酶，分子量為96 kDa，酶的最適溫度和最適pH分別為40℃和7.5。37℃下對熒光底物

3、Leu-MCA分解的米氏常數(shù)Km和Kcat值分別為1.55μmol/L和26.4 s-1，水解反應(yīng)的活化能(Ea)為59.6kJ/mol。蛋白酶抑制劑Bestatin對LAP表現(xiàn)為競爭性抑制作用，抑制常數(shù)(K1)為1.44μmol/L。Zn2+和Cd2+對真鯛LAP的抑制作用類型均為混合型抑制，抑制常數(shù)(K1)分別為3.54 mmol/L和0.92mmol/L，對酶-底物絡(luò)合物的抑制常數(shù)(K1S)則分別為4.49 mmol/L和5.9

4、mmol/L。亮氨酸、色氨酸和苯丙氨酸對LAP的抑制均為競爭性抑制作用，其抑制常數(shù)(K1)分別為0.54、0.21和1.19 mmol/L；半胱氨酸對LAP為混合型抑制效應(yīng)，抑制常數(shù)K1為0.26 mmol/L，對酶-底物絡(luò)合物的抑制常數(shù)K1S為9.43 mmol/L。利用制備的兔抗真鯛LAP多克隆抗血清進(jìn)行免疫組化分析表明，LAP在真鯛肌肉細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)主要呈點(diǎn)狀小顆粒樣分布，免疫學(xué)檢測表明在真鯛不同組織器官中廣泛分布有LAP。此外，L

5、AP在鯉魚、鯽魚、草魚、鰱魚、胡子鯰和藍(lán)園鲹等魚類肌肉中都有存在。 通過硫酸銨沉淀、DEAE-Sephacei離子交換、Phenyl-Sepharose疏水層析和羥基磷灰石層析，從真鯛肌肉中純化到一種具有分解明膠能力的絲氨酸蛋白酶(SP)。SP的分子量為85 kDa，酶的最適溫度和最適pH分別為40℃和8.0。絲氨酸蛋白酶抑制劑可明顯抑制SP活性，其他類型蛋白酶抑制劑對其活性沒有明顯影響。該蛋白酶對熒光合成底物Boc-Leu-L

6、ys-Arg-MCA的米氏常數(shù)Km和Kcat值分別為3.58μmol/L和0.13s-1。實(shí)驗(yàn)表明，SP與其它已報(bào)道的肌肉肌漿可溶性絲氨酸蛋白酶(MSSP)和肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶(MBSP)的酶學(xué)特性均有較明顯差異，可能是一種具有獨(dú)特酶學(xué)性質(zhì)的新型絲氨酸蛋白酶。SP對明膠和真鯛Ⅰ型膠原蛋白具有明顯分解能力，對真鯛肌球蛋白重鏈也有明顯分解作用，推測其可能是參與魚肉保鮮過程肌肉軟化的一種重要蛋白酶。 通過硫酸銨沉淀、DEAE-

7、Sephacel離子交換層析、Phenyl-Sepharose疏水層析和Gelatin-Sepharose親和層析，從真鯛肌肉中純化到一種依賴鈣離子的金屬蛋白酶(MP)。MP的分子量為52 kDa，酶的最適溫度和最適pH分別為40℃和8.0，金屬蛋白酶抑制劑可明顯抑制其活性，其它蛋白酶抑制劑對MP活性則沒有抑制作用。MP活性完全依賴Ca2+的存在，性質(zhì)分析顯示MP可能是一種類哺乳動物基質(zhì)金屬蛋白酶。MP對明膠和真鯛Ⅰ型膠原蛋白具有較明顯

8、的分解作用，對真鯛肌原纖維蛋白如肌球蛋白重鏈、肌動蛋白、α-輔肌動蛋白和伴肌動蛋白等具有明顯分解作用，推測其很可能是引起魚肉保鮮過程中肌肉軟化的主要蛋白酶之一。 利用分子克隆技術(shù)，從真鯛肌肉組織中克隆了類哺乳動物金屬蛋白酶組織抑制劑2(TIMP-2)編碼成熟蛋白區(qū)域的基因序列，該基因序列為585 bp，推導(dǎo)編碼194個(gè)氨基酸殘基，與來自真鯛囊胚細(xì)胞、牙鲆、斑馬魚、大西洋鮭魚和人TIMP-2氨基酸序列同源性分別為100％、91％、

9、80％、72％和70％，與人TIMP1，3和4的同源性均約為40％。通過基因工程技術(shù)，構(gòu)建了重組酵母系統(tǒng)分泌性表達(dá)TIMP-2。在搖瓶培養(yǎng)狀態(tài)下，rTIMP-2表達(dá)水平可達(dá)10 mg/L，用Ni-NTA親和層析可一步高度純化rTIMP-2。rTIMP-2對真鯛和鯉魚肌肉肌漿金屬蛋白酶有抑制作用，對明膠酶A樣的基質(zhì)金屬蛋白酶抑制作用明顯。 魚類肌肉中蛋白酶及其內(nèi)源性抑制劑種類多樣，功能各異，它們共同參與肌肉蛋白新陳代謝和魚死后冷藏