煙草Kunitz型胰蛋白酶抑制劑基因的分離及功能鑒定.pdf_第1頁(yè)
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1、植物病害是世界范圍內(nèi)影響作物產(chǎn)量的最嚴(yán)重的生物脅迫之一,嚴(yán)重影響了作物產(chǎn)量和品質(zhì)。而80%的作物病害是由病原真菌引起的。立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)是半知菌亞門(mén)絲核菌屬的一個(gè)種,為死體營(yíng)養(yǎng)菌,分布廣、寄主范圍大,常以菌核形態(tài)習(xí)居土壤,是小麥、玉米、水稻等禾本科作物紋枯病,草坪草褐斑病,馬鈴薯、棉花、大豆、煙草立枯病的致病菌。雖然該病研究多年,但研究進(jìn)展較少,主要進(jìn)展也僅僅集中在生物防治領(lǐng)域。在植物抗病基因工程中,通

2、過(guò)將抗真菌蛋白基因轉(zhuǎn)入植物來(lái)提高農(nóng)作物對(duì)真菌病害的抗性已成為一種直接有效的方法,并且在一些重要作物改良中取得了一定進(jìn)展。 本研究通過(guò)構(gòu)建真菌誘導(dǎo)煙草幼苗cDNA文庫(kù),并用反向Northern差異篩選法獲得一個(gè)與生物脅迫相關(guān)的Kunitz型蛋白酶抑制劑基因NtKTI1。本研究對(duì)NtKTI1基因序列、表達(dá)及生物學(xué)功能進(jìn)行了重點(diǎn)分析,主要研究結(jié)果如下: 1、利用Clontech SmartTM cDNA Library Con

3、struction Kit構(gòu)建真菌誘導(dǎo)煙草cDNA文庫(kù),通過(guò)反向Northern差異篩選法分離獲得一個(gè)長(zhǎng)563bp的cDNA片斷。應(yīng)用RACE技術(shù)得到這個(gè)基因的全長(zhǎng),命名為NtKTI1。該基因全長(zhǎng)840bp,編碼區(qū)長(zhǎng)627bp。估計(jì)分子量為23.1kDa,等電點(diǎn)為9.36。該基因在GenBank中的注冊(cè)號(hào)為FJ494920。 2、同源比對(duì)分析表明NtKTI1與非洲奇果蛋白、植物Kunitz型蛋白酶抑制劑等蛋白具有很高的同源性,分

4、子內(nèi)有兩對(duì)二硫鍵和一個(gè)活性中心。使用JPred,SWISSMODEL,CPHmodels和ESyPred3D等蛋白質(zhì)二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析表明NtKTI1與KTI3具有類(lèi)似的三維結(jié)構(gòu)。隨后使用Swiss-Model和RasMol構(gòu)建了NtKTI1的三維模型。 3、采用生物信息學(xué)的手段在擬南芥和水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中搜尋NtKTI1的同源基因,從擬南芥中找到7個(gè),水稻中僅找到1個(gè)。聚類(lèi)分析表明NtKTI1與AtIg17860,A

5、tIg73260,Os04g0526600聚到一個(gè)進(jìn)化枝上。 4、RT-PCR及Northern表達(dá)分析表明NtKTI1在根和莖中表達(dá)量最高,其次是花和葉中,在種子中的表達(dá)量很低。在尼R.solani,SA和傷處理時(shí),NtKTI1在一定的時(shí)間范圍內(nèi)其表達(dá)水平隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低,但不受MeJA,ABA和NaCl處理的影響。由PRIc的表達(dá)模式推測(cè)煙草在立枯絲核菌侵染時(shí)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)模式類(lèi)似于傷信號(hào)是依賴(lài)SA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。 5

6、、使用hiTAIL-PCR的方法擴(kuò)增得到NtKTI1長(zhǎng)為1471bp的調(diào)控序列,PlantCare預(yù)測(cè)出多個(gè)逆境脅迫響應(yīng)元件。 6、構(gòu)建原核表達(dá)載體誘導(dǎo)純化得到缺失信號(hào)肽序列而帶有組氨酸標(biāo)簽的NtKTI1融合蛋白。酶活測(cè)定結(jié)果表明該融合蛋白具有胰蛋白酶抑制劑活性。抑菌圈試驗(yàn)結(jié)果表明該融合蛋白對(duì)立枯絲核菌具有很強(qiáng)的抑菌活性,對(duì)桃根霉、煙草疫霉的抑菌活性較弱,但對(duì)細(xì)菌如E.Coli沒(méi)有作用。 7、構(gòu)建NtKTI1的植物正義反

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