Bowman-Birk型大豆胰蛋白酶抑制劑的分離純化及性質(zhì)研究.pdf

1、胰蛋白酶抑制劑廣泛存在于動、植物和微生物中，泛指具有抑制胰蛋白酶活性作用的多肽或者蛋白質(zhì)。研究表明大豆中至少含有5種胰蛋白酶抑制劑，但目前其中只有庫尼茲(KTI)、包曼-伯克(BBI)兩種類型抑制劑被分離。 ㈠對粗BBI的提取研究。首先采用乙醇對BBI進(jìn)行進(jìn)取，通過單因素實(shí)驗(yàn)確定了比較適宜的乙醇提取條件，包括乙醇濃度40％～80％、液料比(乙醇質(zhì)量g/干燥脫脂大豆粉質(zhì)量g)4～6、提取時(shí)間30～60min和提取溫度30～60℃

2、。然后利用正交試驗(yàn)得出最佳的乙醇提取條件為：乙醇濃度65％，液料比(乙醇質(zhì)量g/干燥脫脂大豆粉質(zhì)量g)為5，提取時(shí)間60min，提取溫度60℃。乙醇提取后，又采用等電點(diǎn)法,調(diào)pH值，Bowman-Birk型大豆胰蛋白酶抑制劑的等電點(diǎn)為4.2，使胰蛋白酶抑制劑在等電點(diǎn)時(shí)達(dá)到最大沉淀，然后加入丙酮，沉淀溶液中的胰蛋白酶抑制劑。并做單因素實(shí)驗(yàn)得出最佳丙酮用量為：丙酮質(zhì)量g/調(diào)pH值后溶液質(zhì)量g=2。再進(jìn)行超濾，選出超濾的各項(xiàng)參數(shù)。包括超濾壓力

3、60kPa，超濾溫度35℃。最后進(jìn)行真空干燥得出粗BBI晶體。根據(jù)Bradford法按最佳乙醇提取條件和最佳丙酮用量以及上述超濾條件測得BBI粗晶體得率為6.1mg/g。根據(jù)BAPNA法以Sigma公司BBI為標(biāo)準(zhǔn)品測得BBI粗晶體中BBI的總含量為93.7％。 ㈡對粗BBI純化的研究。本實(shí)驗(yàn)采用DEAE-25離子交換層析和SephadexG-50凝膠柱過濾，得出的純品，根據(jù)BAPNA法以Sigma公司BBI為標(biāo)準(zhǔn)品測得實(shí)驗(yàn)所

4、得純品純度為99.8％。 ㈢采用BAPNA法測定BBI抑制活性，得出BBI的量與吸光度變化值之間的正比變化關(guān)系。 本研究同時(shí)對BBI的穩(wěn)定性做了研究，分別改變影響B(tài)BI抑制活性的條件.以得到BBI穩(wěn)定性方面的數(shù)據(jù)。對BBI抑制活性影響的因素有溫度、pH值、還原劑。分別在不同的溫度下處理BBI,同時(shí)采用BAPNA法測定BBI抑制胰蛋白酶吸光度變化值。得出BBI的熱穩(wěn)定性。配制不同pH值的緩沖液處理BBI，pH3.0，采

5、用1.0mol/L的甘氨酸-HCl緩沖液；pH4.0～6.0，采用0.1mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液;pH7.0，采用0.1mol/L磷酸二氫鈉-磷酸二鈉鹽緩沖液;pH8.0～9.0采用0.1mol/L的Tris-HCl緩沖液；pH10.0～12.0采用0.1mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，處理12h觀察其抑制活性的變化，然后用pH18.0的緩沖液處理12小時(shí)，再觀察其抑制活性的變化。pH值的變化對BBI的抑制活性的改變是可逆的