大豆胰蛋白酶抑制劑的制備、理化性質(zhì)和抗黃油霉作用.pdf

1、大豆乳清是工業(yè)上采用堿提、酸沉等工藝制備大豆分離蛋白的副產(chǎn)物。目前,我國(guó)每年排放的大豆乳清廢棄液在300萬(wàn)噸以上,這既造成了大量的資源浪費(fèi)又造成了環(huán)境的污染。而大豆乳清液中含有大量的功能性成分,如其中的胰蛋白酶抑制劑具有多種生理功能,在生物農(nóng)藥、醫(yī)藥等領(lǐng)域均有著廣泛的應(yīng)用前景。對(duì)于胰蛋白酶抑制劑的分離、純化工作,目前僅在實(shí)驗(yàn)室水平上采取水浸、酸提、鹽析、凝膠過(guò)濾層析等較為繁雜的方法純化制得,耗時(shí)長(zhǎng)、產(chǎn)率和純度也不高;還有利用瓊脂糖凝膠親

2、和純化制得,但其材料價(jià)格昂貴且活化時(shí)具有較大毒性。
　　 黃曲霉在自然界中分布很廣,能侵染飼料、花生、油料等各種食物,而黃曲霉侵染后所產(chǎn)生的黃曲霉毒素是化合物中毒性最強(qiáng)的有害物質(zhì)之一。目前,關(guān)于黃曲霉對(duì)食物浸染的控制研究還僅僅局限于采用通風(fēng)、控制濕度和溫度等物理方法,及添加有毒的化學(xué)抑菌劑等方法,而在花生、玉米及其他農(nóng)產(chǎn)品中添加天然生物抑菌劑,以減弱黃曲霉侵染作用的研究還鮮有報(bào)道。
　　 本文利用殼聚糖、大豆及野生大豆為

3、原料,將制備的殼聚糖樹脂-胰蛋白酶親和介質(zhì),應(yīng)用于胰蛋白酶抑制劑的分離、純化中,并研究胰蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)性質(zhì)及其抗黃曲霉侵染活性,為開發(fā)控制花生、玉米等食品中黃曲霉毒素含量的生物制劑提供理論支持和應(yīng)用基礎(chǔ)。
　　 1)殼聚糖樹脂制備條件的優(yōu)化:當(dāng)殼聚糖溶液2.0％(w/v),攪拌速度300r/min,戊二醛終濃度3.6％(v/v),還原劑NaBH4終濃度0.06 mol/1時(shí),制備的殼聚糖樹脂尺寸均一,球狀規(guī)整,平均粒徑約為41

4、6 μm,適合于作為固定化酶的載體。經(jīng)FTIR,XRD和DSC分析發(fā)現(xiàn),交聯(lián)反應(yīng)主要是通過(guò)殼聚糖糖環(huán)上的氨基與戊二醛的醛基結(jié)合形成Shicff堿結(jié)構(gòu),連接分子間或分子內(nèi)的殼聚糖分子進(jìn)而形成球狀的殼聚糖樹脂。此外,戊二醛和NaBH4的添加量直接影響著制備樹脂的孔度值、交聯(lián)度及樹脂表面的微觀結(jié)構(gòu)等。
　　 2)殼聚糖樹脂-胰蛋白酶制備條件的優(yōu)化:以制備的殼聚糖樹脂為載體,采用低毒、高效的環(huán)氧氯丙烷為活化劑,胰蛋白酶為偶聯(lián)劑,制備了殼

5、聚糖樹脂-胰蛋白酶親和介質(zhì)。其最佳制備工藝條件為,環(huán)氧氯丙烷終濃度15％,活化溫度60℃,偶聯(lián)溫度30℃,活化過(guò)程中加入適量的NaBH4和1,4-二氧六環(huán)。正是由于胰蛋白酶的固定化防止了蛋白肽鏈的折疊纏繞,保護(hù)了其三級(jí)結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)域不被過(guò)高的溫度或環(huán)境所破壞,因此擁有較高的溫度和pH耐受性,且具有良好的貯藏穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性。
　　 3)胰蛋白酶抑制劑親和純化:采用鹽析和等電點(diǎn)沉淀法從大豆及野生大豆乳清液中提取胰蛋白酶抑制劑粗品,

6、然后以制備的殼聚糖樹脂-胰蛋白酶為親和介質(zhì)進(jìn)行一步親和純化,制得大豆胰蛋白酶抑制劑。純化后的胰蛋白酶抑制劑經(jīng)SDS-PAGE分析,呈現(xiàn)單一譜帶,相當(dāng)分子量為8.2 kDa,且親和純化倍數(shù)、比活力及活性回收率均較高。經(jīng)其復(fù)合物分析、全水解氨基酸分析及氨基酸殘基的化學(xué)修飾等方法證明,純化制備的抑制劑屬于Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制劑。
　　 4)抗黃曲霉侵染活性:大豆及野生大豆胰蛋白酶抑制劑對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)具有較強(qiáng)的抑制活性,其

7、IC50值分別為1.6 μM和1.2 μM。當(dāng)其濃度達(dá)到1.8μM時(shí),可極大程度的抑制黃曲霉孢子萌發(fā)和菌絲體的生長(zhǎng)。此外,通過(guò)黃曲霉分泌的α-淀粉酶和蛋白酶的活性及其對(duì)底物(淀粉、酪蛋白)的利用情況,發(fā)現(xiàn)抑制劑抑制黃曲霉生長(zhǎng)的具體機(jī)理是通過(guò)抑制α-淀粉酶和蛋白酶的活性,進(jìn)而限制黃曲霉分解碳水化合物所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的產(chǎn)生,阻斷黃曲霉毒素的分泌和產(chǎn)生。
　　 5)殼聚糖-胰蛋白酶抑制劑復(fù)合膜的制備及應(yīng)用:以殼聚糖、胰蛋白酶抑制劑粗提取物

8、為原料,甘油為增塑劑,即當(dāng)殼聚糖濃度1.8％,抑制劑粗提取物濃度0.2％,甘油濃度1.2％,干燥溫度45℃時(shí),制備的復(fù)合膜具有較強(qiáng)抗黃曲霉活性。且復(fù)合膜表面及內(nèi)部嚴(yán)緊致密,結(jié)構(gòu)均一,分子間靠形成更多的氫鍵維持其穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。將該復(fù)合膜液涂膜于花生上,發(fā)現(xiàn)此復(fù)合膜對(duì)黃曲霉的侵染具有較強(qiáng)的抑制作用。
　　 我國(guó)是世界花生的生產(chǎn)、消費(fèi)和出口的主要國(guó)家,對(duì)于黃曲霉毒素污染問(wèn)題目前仍無(wú)最佳防治技術(shù)。本研究在充分利用大豆乳清液資源和殼聚糖資源