重組南瓜胰蛋白酶抑制劑Ⅰ在畢赤酵母中的表達(dá)和性質(zhì)研究.pdf

1、本研究選用質(zhì)粒pGAPZαA作為載體構(gòu)建含目的基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pGAPZαA-CMTI Ⅰ,并通過PCR、酶切鑒定以及DNA測序后,將陽性重組子進(jìn)行大量的培養(yǎng)擴增,抽提質(zhì)粒,經(jīng)Bln Ⅰ酶切線性化后電擊轉(zhuǎn)化進(jìn)入表達(dá)載體巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris,Pp)GS115中.轉(zhuǎn)化后在含抗生素Zeocin的低鹽YPDS培養(yǎng)基上進(jìn)行平板篩選,獲得20個具有抗性的菌落,通過對這20個菌落表達(dá)上清進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE

2、篩選獲得高表達(dá)菌株1個.Tricine-SDS-PAGE結(jié)果顯示,陽性重組菌的表達(dá)產(chǎn)物較空白菌在3.0kD處有一條明顯的rCMTI Ⅰ條帶,占分泌蛋白總量的6.21%,表達(dá)量為609mg/L.采用親和分離技術(shù)對重組表達(dá)產(chǎn)物rCMTI Ⅰ進(jìn)行了分離純化.首先制備了殼聚糖多孔珠,并以戊二醛為交聯(lián)劑將胰蛋白酶交聯(lián)于其上獲得了親和吸附劑,還考察了殼聚糖多孔珠以及殼聚糖多孔珠親和吸附劑的性質(zhì).然后用所制備的親和吸附劑采用靜態(tài)吸附和洗脫方式從含有表

3、達(dá)產(chǎn)物的培養(yǎng)基中直接分離純化rCMTI Ⅰ.最后通過Sephadex G-10層析對獲得的洗脫液冷凍干燥品進(jìn)行脫鹽和進(jìn)一步純化,獲得了基本純化的rCMTI Ⅰ.經(jīng)Tricine-SDS-PAGE分析,純化rCMTI Ⅰ的分子量約為3.2kD,與文獻(xiàn)報道的CMTI Ⅰ的分子量一致.純化產(chǎn)物具有抑制胰蛋白酶活性的作用.本論文還對rCMTI Ⅰ的相關(guān)性質(zhì)進(jìn)行了研究.研究證明rCMTI Ⅰ為胰蛋白酶的非競爭性可逆性抑制劑,其抑制常數(shù)Ki為4.5