獼猴桃果膠甲酯酶抑制劑的基因克隆及在畢赤酵母中的高效表達(dá).pdf

1、果蔬汁主要由漿液和渾濁態(tài)物質(zhì)構(gòu)成。渾濁態(tài)在果蔬汁的顏色、風(fēng)味、質(zhì)地等感官品質(zhì)方面發(fā)揮重要作用，然而果蔬汁在儲(chǔ)存過程中，經(jīng)常會(huì)發(fā)生渾濁態(tài)消失(cloud loss)的現(xiàn)象，這主要是由于果蔬汁內(nèi)源果膠甲酯酶對(duì)果膠的脫甲酯化作用而產(chǎn)生的。果膠甲酯酶抑制劑(PMEI)可有效抑制植物內(nèi)源果膠甲酯酶(PME)的活性，為解決果蔬汁混濁態(tài)消失提供了一個(gè)非常具有應(yīng)用前景的方法。然而從植物體中直接提取PMEI很困難，并且產(chǎn)量很低，目前只是從獼猴桃果實(shí)中獲取

2、到該抑制劑。本文利用巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)高效表達(dá)出獼猴桃的果膠甲酯酶抑制劑，毫無疑問，這將有力促進(jìn)果膠甲酯酶抑制劑在果蔬汁中的應(yīng)用。 (1)從新鮮成熟的獼猴桃果實(shí)中提取總RNA，立即被反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)GenBank中已發(fā)表的獼猴桃果膠甲酯酶抑制劑PMEI的cDNA序列，設(shè)計(jì)合成特異引物，以獼猴桃cDNA為模板，通過RT-PCR得到-DNA產(chǎn)物，該序列與已發(fā)表的PMEI序列的同源性很高，被命名為kW

3、PMEI。 (2)經(jīng)過EcoR Ⅰ和Not Ⅰ的雙酶切作用，將kWPMEI定向插入到質(zhì)粒pPIC9K的多克隆位點(diǎn)(MCS)上，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K/kWPMEI。經(jīng)Sac Ⅰ線性酶切處理后，該質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化的方法被整合到巴斯德畢赤酵母KM71的基因組中，獲得His<'+>轉(zhuǎn)化子，再經(jīng)G418抗性的二次篩選，最終獲得6株含高拷貝kWPMEI的重組畢赤酵母菌株。 (3)將含不同拷貝數(shù)的重組菌株，在BMGY/BMMY培

4、養(yǎng)基中進(jìn)行表達(dá)，將表達(dá)出來的目的蛋白命名為kWPMEI。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明kWPMEI的表達(dá)量與重組菌株所含的拷貝數(shù)增加成正相關(guān)性，即重組菌株所含拷貝數(shù)越多，kWPMEI的表達(dá)量越高。此外，kWPMEI可被直接分泌到培養(yǎng)基中，占上清液蛋白量的絕大多數(shù)，因此通過一步凝膠過濾層析法即被純化出來。 (4)通過凝膠擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)，分別檢測(cè)。kWPMEI對(duì)番茄、桔子和胡蘿卜PME的抑制作用，發(fā)現(xiàn)kWPMEI對(duì)上述三種植物的PME均有抑制活性。kWPM