色素熒光蛋白基因的克隆及在畢赤酵母中表達.pdf

1、綠色熒光蛋白(GFP)具有優(yōu)異的熒光活性，作為報告基因與靶蛋白融合，示蹤靶蛋白在活細胞內的位置、移動及相互作用。藍細菌中的色素蛋白具有豐富的光譜范圍，可彌補綠色熒光蛋白光譜的不足，拓展熒光蛋白標簽在細胞生物學研究中的應用。綠色熒光蛋白與色素蛋白的融合進一步拓寬光譜的檢測范圍，能用作二色、多色標記，可作熒光探針用于定位。另外，藍細菌中色素蛋白潛在的生物活性也引起人們的重視，如作為光敏劑和抗氧化活性用于光動力學治療。
　　 本文研究

2、包括以下幾個方面：
　　 (1)綠色熒光蛋白肌動蛋白融合基因的克隆與在原核表達系統(tǒng)中表達。首先從大腸桿菌中克隆出肌動蛋白基因mreB，與gfp基因融合，構建質粒pCDFDuet-mreB：gfp，轉入大腸桿菌，經熒光顯微鏡圖像、熒光和吸收光譜特征以及蛋白質電泳結果證明融合基因在大腸桿菌中表達。
　　 (2)綠色熒光蛋白和膽綠素還原酶基因pcyA在畢赤酵母菌株GS115中表達。首先構建酵母質粒pPICZB-gfp和pPIC

3、ZB-gfp：pcyA，以電轉化方式分別導入巴斯德酵母菌株GS115基因組中，篩選陽性克隆子，進行誘導表達。由熒光顯微鏡圖像，熒光和吸收光譜特征以及蛋白質電泳結果證明gfp基因和gfp：pcyA融合基因在酵母中表達成功，初步建立畢赤酵母表達系統(tǒng)，構建出外源蛋白的酵母表達平臺。
　　 (3)畢赤酵母雙色熒光蛋白表達體系的構建。首先克隆出酵母線粒體膜蛋白基因f0并與gfp(△SacI)：pcyA基因融合，構建酵母表達質粒pPIC3.

4、5K：f0：gfP(△SacI)：pcyA，以電轉化方式導入菌株GS115基因組中，得到的陽性克隆子誘導表達。通過熒光顯微鏡圖像、熒光和吸收光譜特征篩選出工程菌GS115/pPIC3.5K：f0：gfp(△SacI)：pcyA。然后構建含GAF3結構域的光敏色素酵母質粒 pPICZB：abp1：gaf3：ho1，同樣以電轉化方式導入工程菌GS115/pPIC3.5K：f0：gfp(△SacI)：pcyA基因組中。經PCR篩選的陽性克隆子