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1、湖北大學(xué)碩士學(xué)位論文IL1RaHSA基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達(dá)姓名：胡磊申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：微生物與生化藥學(xué)指導(dǎo)教師：劉夢(mèng)元20090501AbstractInterleukin一1receptorantagonist(IL一1Ra)，anaturallyoccurringantagonistoftheproinflammatorycytokineIL1IL1RacompetitivelyblocksthebindingofI
2、L壚toIL1membranereceptorsandhasawonderfultherapeuticeffectFortheinflammation，autoimmunediseasesToprolongthehalflifeofIL1Rainvivo，wedevelopedalong—actingIL1Ra(ILIRaHSA)byalbuminfusiontechnologyThefusedgeneILIRa—HSAwasexpre
3、ssedinPichiapastorisGSll5ThewholeaminoacidssequenceofILlRawasbacktranslatedintoDNAsequencewiththepriorcodonsofPichiapastoris14oligonucleotidesweresynthesizedbasedontheDNAsequenceandthePCRwasperformedtoassemblethe14oligon
4、ucleotidestoanintactgenefragmentcodingforILl—RaThegenefragmentwasclonedintovectorpUCM—TandtransformedintoEcoliDH5ahostbacteriaPCRidentifiedthebacteriaandsequencedfromselectedpositiveclonedbacteriaTheresultsshowedthatthew
5、hole458bpofILl—RawereClonedsuccessfullyAccordingtotheeDNAsequenceofHSAderivedfromtheGenebank(V00495)，apairofprimerswasdesignedRTPCRwasappliedtoamplifythewholeeDNAofHSAgeneTheeDNAfragmentWasclonedintovectorpUCM—Tandtransf
6、ormedintoEcoliDH5ahostbacteriaPCRidentifiedthebacteriaandsequencedfromselectedpositiveclonedbacteriaTheresultsshowedthatthewhole1758bpeDNAofHSAwereClonedsuccessfullyandcomparedwiththesequencedepositedinGeneBanks，andtheho
7、mologywas9999％AftersplicingILl—RaandHSAgengesinvitrobyoverlappingPCRtechnologythefusedgenewasclonedintoplasmidpMD18一TandthensequencedTherecombinantplasmidwasnamedpMDl8TILIRaHSATheconfirmedfusedgenewasrecoveredfromtheplas
8、midwithrestrictionendouncleaseCpoIandNotltheninsertitintoexpressionvectorpHBM9005BtoconstructrecombinantexpressionvectorpHBM—ILlRaHSATheresultsshowedthattheclonedfusedgenewasincorrespondencewithouranticipationandexpressi
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