豬IL-2基因的克隆及在畢赤酵母中的表達與分析.pdf

1、白細胞介素2(Interleukin-2，IL-2)主要是由T細胞和NK細胞等產(chǎn)生的15.5～17.2Ku的糖蛋白。IL-2是細胞免疫應(yīng)答過程中的一個初始因子，在免疫學(xué)中起著非常重要的作用，其最重要的功能是誘導(dǎo)T淋巴細胞增殖和分化，并且具有刺激T輔助細胞和自然殺傷細胞分泌細胞因子等功能。目前，在國內(nèi)人的重組IL-2己在臨床上得到廣泛的應(yīng)用，但對重組豬IL-2的研究較少。為了研究和開發(fā)豬IL-2用于相關(guān)疫病的治療或預(yù)防，我們首先克隆了豬I

2、L-2基因，然后利用基因工程技術(shù)在巴斯德畢赤酵母中進行表達、純化和分析研究。 1.本研究采用刺激誘導(dǎo)技術(shù)和RT-PCR技術(shù)，從外周血單個核細胞中成功克隆到豬IL-2基因，其全長465bp，共編碼154個氨基酸殘基的前體蛋白，分子量約為17.24Ku。分析表明：克隆的豬IL-2基因序列與參考序列的同源性為98％，與人、牛、狗的同源性較高，而與雞的同源性較低。 2.將豬IL-2基因和真核表達載體pPIC9K同時酶切構(gòu)建重組表

3、達載體，轉(zhuǎn)化JM109菌后，提取重組表達質(zhì)粒pPIC9K-IL-2。采用限制性內(nèi)切酶SalI將重組質(zhì)粒pPIC9K-IL-2線性化后，通過電擊法將其轉(zhuǎn)化到巴斯德畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞中，并用G418抗性梯度篩選法，獲得高拷貝重組菌株，然后利用1％甲醇進行誘導(dǎo)表達，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析表明：在搖床水平中表達出約17Ku大小的分泌性目的蛋白。 3.通過對pH、溫度和溶氧水平等發(fā)酵工藝條件的調(diào)整，將高拷貝重組畢赤酵母菌株在