植酸酶基因phyA的克隆及在畢赤酵母中的高效表達(dá).pdf

1、植酸(肌醇六磷酸)是植物飼料中磷的主要貯存形式。由于單胃動(dòng)物(如家禽、豬等)體內(nèi)缺乏分解植酸的酶，因此植酸磷難以得到有效利用。 植酸酶，即肌醇六磷酸磷酸水解酶，在飼料中添加植酸酶則可提高植物性飼料中磷的利用率和單胃動(dòng)物對(duì)礦質(zhì)元素的吸收，并減輕動(dòng)物排泄物中磷對(duì)環(huán)境的污染，這使得植酸酶作為飼料添加劑具有廣泛的應(yīng)用前景。 植酸酶廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中，但是天然材料中植酸酶活性很低，為了得到大量的植酸酶，人們利用基因工程

2、技術(shù)構(gòu)建植酸酶基因工程菌株實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)；在分子水平上對(duì)植酸酶基因進(jìn)行改造，如提高耐熱性、催化活性以及對(duì)單胃動(dòng)物胃腸道pH的適應(yīng)性等，使其更適合作為飼料添加劑在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮催化作用。 本文以自行篩選的產(chǎn)胞外植酸酶的黑曲霉菌株．dspergillus niger N-J為出發(fā)菌株，克隆植酸酶phyA基因，并將其連接構(gòu)建到畢赤(Pichiapastoris)酵母分泌型表達(dá)載體pPICZcxA中，利用電擊轉(zhuǎn)化的方法將pPICZetA/p

3、gyA轉(zhuǎn)入畢赤酵母中，構(gòu)建植酸酶酵母工程菌株，高效表達(dá)了有良好應(yīng)用性質(zhì)的胞外植酸酶。本實(shí)驗(yàn)的主要結(jié)果如下： 1．產(chǎn)胞外植酸酶的黑衄霉菌株的篩選將從不同地方采集的土壤樣品在含有植酸鈣的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，能夠水解植酸鈣產(chǎn)生透明圈的菌株即為陽(yáng)性菌株，微生物學(xué)鑒定為黑曲霉，命名為．Aspergillus nigerN-J。 2．黑曲霉A．niger N-J植酸酶ppyA基因的克隆利用改進(jìn)的氯化芐法提取A．niger N-J基

4、因組，并以基因組DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增出大小約為1.4 kb的植酸酶phyA基因片段。序列分析表明phyA開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為1347 bp，包含編碼448個(gè)氨基酸的植酸酶成熟肽的完整序列；其核苷酸序列與A．nigerNRRL3135 phyA基因(GenBank Accession No．Z16414)的同源性為96.44％，推導(dǎo)出的氨基酸序列同源性為97.77％。在phyA基因編碼的氨基酸序列中，存在11個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)及組

5、氨酸酸性磷酸酶的活性位點(diǎn)保守序列RHGARYP，位于氨基酸序列的+62～+68。 3．黑曲霉A．niger N-J植酸酶phyA基因在畢赤酵母中的高效表達(dá)將pMD-T/PhyA 質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后構(gòu)建植酸酶酵母表達(dá)載體pPICZaA/phyA。將重組表達(dá)載體pPICZαA/phyA質(zhì)粒用Pme I線性化后電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母Pichia pastoris GSll5，經(jīng)抗生素Zeocin和酵母PCR．篩選獲得多株酵母工程菌。對(duì)5株酵母工

6、程菌進(jìn)行植酸酶的誘導(dǎo)表達(dá)和生物學(xué)活性測(cè)定，其中一株高表達(dá)工程菌株ZαA-phyA-2，甲醇誘導(dǎo)(終濃度為2％)96 h后發(fā)酵液植酸酶活力達(dá)242,000U/mL，比出發(fā)菌株酶活力(8U/mL)提高了30,000倍，表達(dá)植酸酶的比活力為503,000U/mg蛋白，從而實(shí)現(xiàn)了植酸酶phyA基因在畢赤酵母中的高效表達(dá)。 4．畢赤酵母表達(dá)植酸酶性質(zhì)的研究SDS-PAGE分析表明表達(dá)植酸酶的表觀分子量為66～80 kD左右。表達(dá)的植酸酶對(duì)

7、于植酸鈉和pNPP的K<,m>值分別為0.196 mM和18.15 mM；κ<,eat>/K<,m>分別為2.0×10<'6> M<'-1>s<'-1>和104.7 M<'-1>s<'-1>。其最適反應(yīng)pH值為5.5，在pH值為2.5～5.5的范圍內(nèi)能保持較高的酶活力；在pH 5.5和反應(yīng)時(shí)間為10分鐘的條件下，表達(dá)植酸酶的最適反應(yīng)溫度為55℃；90℃下加熱處理15分鐘仍可保持68.8％左右的酶活力，比世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用的植酸酶飼料添加