人溶菌酶基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達(dá).pdf_第1頁
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文檔簡介

1、該研究是以pUC19-hLY重組質(zhì)粒DNA為模板,通過計(jì)算機(jī)輔助分析,設(shè)計(jì)合成兩對(duì)引物(P1,P2),其5'端和3'端分別帶有xhoI,EcoRI酶切位點(diǎn).通過多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR),擴(kuò)增出人溶菌酶基因片斷,并克隆至pGEM-T載體中,經(jīng)小量提取質(zhì)粒,酶切鑒定篩選出陽性克隆.同時(shí)將其克隆至測序載體pBSKS<'+>中.為了進(jìn)一步證實(shí)hLY基因與畢赤酵母菌(SMD1168)染色體基因組的整合,我們提取酵母菌總DNA,PCR法分析鑒定:h

2、LY穩(wěn)定整合畢赤酵母菌SMD1168梁色體基因組,我們選擇能抗4mg/ml和5mg/mlG418的重組子進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá).表達(dá)產(chǎn)物用SDS-PAGE測定,分子量約為15KD,與hLY分子量14.7KD接近.用薄層掃描分析,分泌蛋白占上清液總蛋白含量的46.7﹪(誘導(dǎo)72h)和32.1﹪(誘導(dǎo)32h).用免疫印跡將表達(dá)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,用抗人溶菌酶抗體與之反應(yīng),加底物顯色后,在人溶菌酶蛋白所在位置可顯示一條特異性條帶,說明表達(dá)產(chǎn)物具有

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