人Ⅲ型膠原蛋白基因的克隆及其對(duì)畢赤酵母的轉(zhuǎn)化.pdf

1、膠原蛋白(collagens)是一類細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，在維護(hù)各種組織的結(jié)構(gòu)完整性方面，扮演著重要的角色。膠原蛋白具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)，并因此而具而有低抗原性和優(yōu)良的生物相容性，使其成為一種重要的生物醫(yī)學(xué)材料，而且這種重要性與日俱增，但膠原主要是從動(dòng)物的組織中提取的，這樣會(huì)帶來(lái)很多麻煩，如免疫排斥和病原菌的污染，因此，利用高效的、規(guī)?；闹亟M體系統(tǒng)來(lái)生產(chǎn)重組人膠原將得到廣泛的應(yīng)用。
　　本研究以流產(chǎn)胎兒的胎皮等為試材，用Trizol提取其總R

2、NA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一條鏈，設(shè)計(jì)特異引物，引入EcoRI和NotI雙酶切位點(diǎn)，優(yōu)化PCR條件，擴(kuò)增出317bp的目的條帶，經(jīng)測(cè)序并與GenBank上公布的人Ⅲ型膠原蛋白α1鏈基因序列比對(duì)，其相似性達(dá)99.66％。同時(shí)，根據(jù)畢赤酵母的密碼子使用情況，人工設(shè)計(jì)并合成了317bp的優(yōu)化基因，將其和天然的人Ⅲ型膠原蛋白α1鏈三肽區(qū)基因分別與表達(dá)載體pET28a-連接，獲得重組原核表達(dá)載體pET-28a-ColⅢ(N)和pET-28a-Co

3、lⅢ(A)，將兩個(gè)重組原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入BL21(DE3)菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳顯示，在13kD處出現(xiàn)蛋白特異條帶，與預(yù)期蛋白大小相符，初步表明目的基因在原核細(xì)胞獲得表達(dá)。
　　將人Ⅲ型膠原蛋白的α1鏈三肽區(qū)基因和密碼子優(yōu)化的類人膠原基因插入到畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K上，構(gòu)建出酵母表達(dá)載體pPIC9K-ColⅢ(N)和pPIC9K-ColⅢ(A)。經(jīng)測(cè)序無(wú)誤后將重組質(zhì)粒用SacⅠ線性化，分別電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌GS