人脂聯(lián)素基因的重疊延伸PCR法克隆及其在畢赤酵母中的誘導(dǎo)表達(dá).pdf

1、本研究利用重疊延伸PCR法克隆出人脂聯(lián)素(ADPN)基因cDNA序列，構(gòu)建了其克隆載體pGEM-T-ADPN。通過(guò)測(cè)序?qū)ζ溥M(jìn)行序列分析后，進(jìn)一步構(gòu)建其畢赤酵母表達(dá)載體pPIC3.5K-ADPN，然后利用電擊法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GSll 5，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)重組酵母表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析和研究，取得了如下進(jìn)展： 利用重疊延伸PCR法從人血液中擴(kuò)增出人脂聯(lián)素基因第二外顯子和第三外顯子編碼序列，并準(zhǔn)確拼接，構(gòu)建了克隆載體pGEM-T-ADPN

2、。通過(guò)PCR和酶切初步鑒定正確后，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果和NCBI中登陸號(hào)為NM 004797.2的人脂聯(lián)素cDNA序列比對(duì)，結(jié)果完全一致，同源性為100％。表明人脂聯(lián)素基因已經(jīng)成功克隆并連接至克隆載體pGEM-T中。 設(shè)計(jì)分別帶有BamH I和EcoR I兩個(gè)酶切位點(diǎn)的人脂聯(lián)素基因引物，以pGEM-T-ADPN為模板，擴(kuò)增出5'端和3'端分別帶有BamH I和EcoRI兩酶切位點(diǎn)的ADPN基因，然后用這兩種酶切后連接至畢赤酵母

3、表達(dá)載體pPIC3.5K中。重組表達(dá)載體pPIC3.5K-ADPN轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5tx并利用其上攜帶的氨芐青霉素抗性基因篩選出抗性菌株，然后做PCR及雙酶切鑒定。經(jīng)鑒定人脂聯(lián)素基因已經(jīng)準(zhǔn)確地連接到畢赤酵母表達(dá)載體pPIC3.5K中。 用電轉(zhuǎn)化法將重組酵母表達(dá)載體pPIC3.5K.ADPN導(dǎo)入甲醇型酵母(Ppastoris)菌株GSll5中，獲得轉(zhuǎn)化子。將轉(zhuǎn)化子采用營(yíng)養(yǎng)缺陷、遺傳霉素、PCR、Soutern雜交篩選后，得到多株重