纖溶酶基因的克隆及其在大腸桿菌和畢赤酵母中的表達.pdf

1、本研究所用纖溶酶ZLW-2來源于保定市屠宰場土壤里篩選出的芽孢桿菌ZLW-2，具有強烈的溶解血栓的作用，可作為一種治療心腦血管疾病新型藥物予以開發(fā)。本文利用基因克隆技術(shù)，分離得到該酶的全長DNA序列，并提交GeneBank，登錄號為EU734749。序列分析表明，Bacillus sp.ZLW-2纖溶酶基因全長1146 bp，包含一個完整編碼閱讀框，編碼381個氨基酸，理論分子量為39.358KD。經(jīng)signalP3.0分析，在29個氨

2、基酸A前為信號肽序列(signal peptide)，后面是一段77個氨基酸殘基組成的前導(dǎo)肽(propeptide)和275個氨基酸殘基的成熟肽(mature peptide)。本序列在GeneBank中BLAST比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，此酶核苷酸序列與日本發(fā)現(xiàn)的納豆激酶NK和納豆激酶AY210091同源性達99％，而且此酶具有和納豆激酶相同的活性中心Asp32，His64 and Ser221和底物結(jié)合中心Ser125，Leu64和 Gly1

3、27，屬于絲氨酸蛋白酶。因此可以初步認(rèn)定此纖溶酶即為納豆激酶。
　　 根據(jù)已測序的纖溶酶EU734749基因序列及原核表達載體pET28a的性質(zhì)，設(shè)計引物分別擴增包括信號肽，前導(dǎo)肽和成熟肽的前纖溶酶原(NK1)序列，包括前導(dǎo)肽和成熟肽的纖溶酶原(NK2)片段以及只包括成熟肽的纖溶酶(NK3)片段，并將其分別連接到表達載體pET28a轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21中進行誘導(dǎo)表達。結(jié)果表明，三種重組質(zhì)粒均具有良好的遺傳穩(wěn)定性，傳代100代后重

4、組質(zhì)粒仍穩(wěn)定存在。其中重組質(zhì)粒pET28a-NK2和pET28a-NK3的工程菌株經(jīng)誘導(dǎo)后并沒有發(fā)現(xiàn)酶活，產(chǎn)物經(jīng)超聲波破碎和包涵體變性復(fù)性后依然沒有檢測到纖溶酶活。而含有前纖溶酶原基因NK1的工程菌在30℃，0.1mmol/L IPTG誘導(dǎo)20h后的表達產(chǎn)物經(jīng)-80℃反復(fù)凍融后酶活可達183U/mL。
　　 為了進一步提高外源基因的穩(wěn)定性及表達量，將纖溶酶原基因pro-nk，nk克隆到畢赤酵母中進行研究。根據(jù)所獲得的基因序列EU

5、734749和真核表達載體pPIC9K的性質(zhì)重新設(shè)計引物，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-pro-nk，pPIC9K-nk。將重組質(zhì)粒線性化后，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，MD，MM快慢型和酶活透明圈初篩，通過檢測重組酵母發(fā)酵上清液中的纖溶酶活性復(fù)篩得到一株外源蛋白產(chǎn)量較高的重組酵母PK53。通過對PK53的生長規(guī)律和發(fā)酵條件的研究發(fā)現(xiàn)，外源基因的穩(wěn)定性很好，即使在沒有選擇壓力存在下，繁殖10代后，其外源基因的丟失率仍為零。在30 ℃,250