單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅱ基因的克隆及其在酵母中的表達(dá).pdf

1、血栓性疾病一直嚴(yán)重威脅著人類的健康。據(jù)相關(guān)資料顯示,全世界每年有1750萬人死于心腦血管病,我國心腦血管疾病患者已經(jīng)超過2.7億人,每年死于心腦血管疾病的患者多達(dá)300萬,已成為心腦血管病發(fā)病和死亡最嚴(yán)重的國家。應(yīng)用溶栓劑進(jìn)行溶栓治療是當(dāng)前治療血栓性疾病的主要手段。目前臨床應(yīng)用的溶栓藥物雖然已經(jīng)發(fā)展到第三代,但很多藥物存在著特異性差,副作用重,半衰期短及生產(chǎn)不易等缺點(diǎn)。因此,對于溶栓特異性好,半衰期長,生產(chǎn)制備容易的溶栓劑的開發(fā)需求迫切

2、。
　　 本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)多年研究,從海洋無脊椎動物單環(huán)刺蜢(Urechis unicinctus)中分離出了一組新型纖溶酶,命名為單環(huán)刺螠纖溶酶(UFE),其中包括4個(gè)不同分子量的組分,按照分子量由大到小,分別是單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅰ(分子量45kDa),單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅱ(分子量26kDa),單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅲ(分子量20kDa)以及單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅳ(分子量8-10kDa)。4個(gè)單環(huán)刺螠纖溶酶組分均具有提高受試機(jī)體繼發(fā)性纖溶活性的能力,具有

3、顯著的抗凝活性和纖溶活性以及較好的生物安全性,具有較大的開發(fā)價(jià)值,但以直接從生物體內(nèi)分離純化的方法進(jìn)行生產(chǎn)存在許多弊端,如生產(chǎn)工藝復(fù)雜,生產(chǎn)質(zhì)量不穩(wěn)定,產(chǎn)率低等。故期望通過本研究克隆得到單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅱ基因,并構(gòu)建出能夠產(chǎn)生重組單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅱ的基因工程菌株。本研究的主要內(nèi)容如下:
　　 1.通過對單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅱ進(jìn)行蛋白質(zhì)N末端測序得到了該酶N-末端氨基酸序列,根據(jù)該氨基酸序列設(shè)計(jì)簡并引物,經(jīng)3'-RACE PCR獲得該組分蛋

4、白質(zhì)的部分編碼序列,進(jìn)一步通過5'-RACE PCR獲得單環(huán)刺蜢纖溶酶Ⅱ基因的全長cDNA編碼序列(共906 bp),其中開放閱讀框長度為795 bp。ufeⅡ全長cDNA序列經(jīng)BLASTx比對,結(jié)果表明該基因編碼產(chǎn)物與絲氨酸蛋白酶家族成員具有較高的同源性,通過PROSITE的ScanProsite軟件分析得出,該蛋白質(zhì)含有一個(gè)trypsin domain(第32-264位),在NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫中分析結(jié)果顯示該酶是一種胰蛋白酶樣絲

5、氨酸蛋白酶。
　　 2.成功構(gòu)建分泌型表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-ufeⅡ-P1/P2,以及piNA1317-ufeⅡ-Y1/Y2,分別對巴斯德畢赤酵母X-33、SMD1168,及解脂耶氏酵母菌進(jìn)行了轉(zhuǎn)化,經(jīng)過對大量陽性轉(zhuǎn)化子的反復(fù)篩選沒有檢測到產(chǎn)生具纖溶酶活性蛋白質(zhì)的菌株。將透析后的發(fā)酵上清液經(jīng)冷凍干燥進(jìn)行濃縮,通過SDS-PAGE對樣品進(jìn)行檢測未見明顯的目的蛋白表達(dá)條帶,通過免疫印跡的方法同樣沒有顯示有目的蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明