單環(huán)刺螠纖溶酶III的基因克隆及表達(dá).pdf

1、血栓類疾病嚴(yán)重威脅著人類的健康，特別是發(fā)達(dá)國(guó)家和多數(shù)發(fā)展中國(guó)家的中老年人。心腦血栓疾病不但發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高，而且具有突發(fā)性。應(yīng)用溶栓藥物進(jìn)行血栓治療是當(dāng)前治療血栓類疾病的主要手段。經(jīng)過(guò)多年的努力探索，從尿激酶的發(fā)現(xiàn)到瑞替普酶的開發(fā)和蚓激酶的使用，血栓類藥物的研究取得了很大進(jìn)展，但仍然存在著半衰期短、特異性差等缺點(diǎn)，因此探索更為理想的溶栓藥物一直是世界的發(fā)展目標(biāo)。
　　本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)多年的實(shí)驗(yàn)研究，從單環(huán)刺螠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)并分離

2、出了4種新型的纖溶酶，分別命名為為單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅰ（UFEI）、單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅱ（UFEⅡ）、單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅲ（UFEIII）及單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅳ（UFEⅣ）。經(jīng)溶栓實(shí)驗(yàn)及藥物安全性的評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，4種纖溶酶體外溶栓效果均強(qiáng)于蚓激酶，并且具有較高的生物安全性，其中UFEIII因分子量小、溶栓活性高等特點(diǎn)，所以具有較大的開發(fā)價(jià)值。但傳統(tǒng)的分離手段重復(fù)性差、得率低，故期望通過(guò)克隆單環(huán)刺螠纖溶酶III的基因，構(gòu)建能產(chǎn)生重組單環(huán)刺螠纖溶酶III的基因

3、工程菌株。本研究的主要內(nèi)容有：
　　1.對(duì)單環(huán)刺螠纖溶酶III進(jìn)行蛋白質(zhì)N端測(cè)序得到該酶的N-末端氨基酸序列，根據(jù)氨基酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，經(jīng)3'-RACE PCR獲得該組分蛋白質(zhì)的部分編碼序列，進(jìn)一步通過(guò)5'-RACE獲得單環(huán)刺螠纖溶酶III基因的全長(zhǎng)cDNA編碼序列（共863bp），其中ORF為786bp。UFEIII全長(zhǎng)cDNA經(jīng)BLASTx比對(duì)，結(jié)果表明該基因編碼產(chǎn)物與絲氨酸蛋白酶家族具有較高的同源性，通過(guò) PROSITE的

4、ScanProsite軟件分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)含有一個(gè)trypsin domain，在NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫(kù)中分析結(jié)果顯示該酶是一種胰蛋白酶樣的絲氨酸蛋白酶。
　　2.構(gòu)建了原核重組表達(dá)載體pET32a-UFEIII、pGEX-6P-1-UFEIII及pET28a-UFEIII轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta2(DE3)中，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)，得到了重組表達(dá)的蛋白，表達(dá)后的發(fā)酵上清進(jìn)行親和層析純化，包涵體進(jìn)行復(fù)性研究，最后均獲得可溶形式的目

5、的蛋白，但未檢測(cè)到活性。
　　3.構(gòu)建了真核分泌性表達(dá)載體pINA1317-UFEIII，轉(zhuǎn)入酵母Y. lipolytica Po1h中進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)過(guò)大量陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選，得到兩株具有較高纖溶酶活性的菌株，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)后，分子量為30kD，大于預(yù)期的分子量，分析原因是產(chǎn)生了糖基化的修飾。用空載上清稀釋陽(yáng)性菌株上清后，纖維蛋白平板測(cè)酶活，發(fā)現(xiàn)隨著目的蛋白濃度的降低，活性也在逐漸降低，進(jìn)一步證明了重組發(fā)酵液中目的蛋白的表達(dá)。