兩種節(jié)肢動物纖溶蛋白酶基因克隆與表達.pdf

1、纖溶性蛋白酶，是類胰蛋白酶絲氨酸蛋白酶家族中一類非常重要的堿性蛋白酶，它們具有很好的纖溶活性，廣泛的存在于各種動物、昆蟲和微生物中。目前，一些纖溶性蛋白酶已經被開發(fā)成用于治療血栓病的藥物。本文以蝎子和黃粉蟲為研究對象，克隆了蝎子體內的纖溶性蛋白酶基因，同時在大腸桿菌BL21(DE3)體內成功的表達出了具有一定纖溶活性的黃粉蟲纖溶性蛋白酶。
　　 作者根據一些已經被克隆出來的纖溶酶的氨基酸序列的保守區(qū)域，設計了一對簡并性引物，然后

2、克隆出了蝎子纖溶酶基因的部分保守片段。通過RACE法對該酶的3'端和5'端的DNA序列進行擴增，最后通過拼接得到了纖溶酶基因的全長序列。該序列全長1427bp，其中包括由1176bp個堿基組成的開放閱讀框(ORF)，編碼了由391個氨基酸殘基組成的蛋白質序列。通過BLAST在NCBI上做同源性比對，該酶與其他物種的纖溶酶的序列相似性在30％～45％之間。我們通過相關的軟件對克隆到的序列進行分析，該酶的N端含有由18個氨基酸殘基組成的信號

3、肽，酶的分子量約為42KDa，具有典型的“催化三聯體”結構。通過模擬它的三維空間結構，我們發(fā)現該酶在活性部位和底結合部位沒有剛性的α螺旋和β折疊，說明該區(qū)域的柔性較高，這樣有利于酶參與催化反應，符合“誘導契合”機制。
　　 我們采用pET32a+質粒構建表達載體，在大腸桿菌BL21(DE3)體內成功的表達了黃粉蟲纖溶酶。通過對表達條件的研究，獲得了如下的最佳培養(yǎng)條件:在LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為30℃，在對數期生長中期（OD6

4、00約為0.6）添加終濃度為1.0mM的IPTG進行誘導，250rpm條件下搖床誘導培養(yǎng)5h，即可獲得一定含量的可溶性目的蛋白。由于大多數的蛋白是以包涵體的形式存在，所以我們采用尿素對包涵體進行變性處理，然后用GEHiTrapIMACFF5mL純化柱通過Ni2+與目的蛋白His標簽的親和層析來分離變性蛋白，最后在透析袋中對純化到的變性蛋白進行復性。通過變復性處理，我們得到了純度較高而且具有一定纖溶活性的表達蛋白。另外，本文也對黃粉蟲纖溶