木瓜凝乳蛋白酶的基因克隆及表達(dá).pdf

1、摘要摘要木瓜凝乳蛋白酶(ChymopaPain，簡稱CHP)是未成熟番木瓜中大量存在的一種半膚氨酸蛋白酶，具有較強(qiáng)的凝乳和蛋白水解能力。木瓜凝乳蛋白酶可以用于Rh血型鑒定、腫瘤的輔助治療、治療腰稚間盤突出癥、消炎、細(xì)胞分離以及啤酒的澄清和奶酪的制造等，在工業(yè)上有廣泛的應(yīng)用。目前使用的木瓜凝乳蛋白酶都提取自天然的番木瓜中。由于番木瓜的乳汁中含有的其他半膚氨酸蛋白酶跟木瓜凝乳蛋白酶具有相似的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，因此給生產(chǎn)高純度的產(chǎn)品造成了較大的困難

2、。為了實(shí)現(xiàn)高純度木瓜凝乳蛋白酶的生產(chǎn)，本文采用畢赤酵母和大腸桿菌對木瓜凝乳蛋白酶進(jìn)行外源表達(dá)的研究，并獲得初步表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)首先從未成熟番木瓜的果肉中提取全mRNA，通過RTPCR克隆出木瓜凝乳蛋白酶基因后，分別將擴(kuò)增產(chǎn)物和空載體pPIcza雙酶切后進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，篩選鑒定后送測序。RTPCR結(jié)果表明擴(kuò)增出預(yù)期大小的DNA片斷，測序結(jié)果確認(rèn)為目的片斷，且插入位置正確.提取構(gòu)建好的質(zhì)粒pPIcza一cP并進(jìn)行單酶切線性化，然后

3、采取電轉(zhuǎn)化的方法將其轉(zhuǎn)進(jìn)畢赤酵母Gsl巧中，經(jīng)Zeocin平板篩選和PCR鑒定后獲得目的轉(zhuǎn)化子。最后進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵表達(dá)。sDs一隊(duì)GE與westem一BIoting結(jié)果表明木瓜凝乳蛋白酶在酵母中的表達(dá)不理想.因此重新設(shè)計引物以pPICza一cP為模板擴(kuò)增出目的基因，分別對PcR產(chǎn)物和pET22一b()進(jìn)行雙酶切，轉(zhuǎn)進(jìn)感受態(tài)大腸桿菌ToP10中，經(jīng)Amp平板篩選和PCR鑒定后測序，結(jié)果證實(shí)載體pETCHP構(gòu)建成功。提取pE不CHP質(zhì)粒轉(zhuǎn)

4、進(jìn)感受態(tài)大腸桿菌BLZI中，進(jìn)行Amp篩選和PcR鑒定后，挑選陽性克隆進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。sDs一以GE與western一Blotting結(jié)果表明木瓜凝乳蛋白酶在大腸桿菌獲得表達(dá)。本論文對木瓜凝乳蛋白酶進(jìn)行了克隆表達(dá)的研究，為木瓜凝乳蛋白酶的工業(yè)生產(chǎn)制備奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞木瓜凝乳蛋白酶畢赤酵母:大腸桿菌表達(dá)ABSTRACTInconclusion，ch卿oPaPainwasattemPtedtobeexPressedinPPastor