鯉魚基質(zhì)金屬蛋白酶--2的基因克隆、表達(dá)及性質(zhì)研究.pdf

1、橐羹夫?qū)W碩士學(xué)位論文鯉魚基質(zhì)金屬蛋白酶．2 鰒基因克隆、表達(dá)及性質(zhì) 研究M o l e c u l a r c l o n i n g ，e x p r e s s , o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fm a t r i x m e t a I I o p r o t e i n a S e ·2f r o mc o m m o n c a r p ‘C y p r i n

2、u sc a r p i o )論文答辯日期： 至Q 羔壘生魚旦墨旦鯉魚基質(zhì)金屬蛋白酶．2 的基因克隆、表達(dá)及性質(zhì)研究摘 要基質(zhì)金屬蛋白酶( M a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e s ，M ] V I P s ) 是能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)( E x t r a c e l l u l a rm a t r i x ，E C M ) 的最重要的金屬離子依賴性蛋白酶。M M P s 參與許多生

3、理、病理過程，廣泛存在于動、植物和微生物體內(nèi)。研究發(fā)現(xiàn)，M M P s 參與魚死后肌肉軟化過程中細(xì)胞外基質(zhì)的降解，而膠原酶和明膠酶在此過程中起到關(guān)鍵作用。作為一種重要 的蛋白酶，基質(zhì)金屬蛋白酶．2 ( 啪．2 ) 參與動物膠原蛋白的新陳代謝，但其在水產(chǎn)動物中的存在情況少有報道．本文以淡水鯉魚為研究對象，克隆得到M M P ．2 基因序列并利用原核表達(dá)系統(tǒng)實現(xiàn)M M P ．2 催化結(jié)構(gòu)域的體外表達(dá)并對重組M M P ．2 的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行深

4、入分析。本研究首先利用R T - P C R 和R A C E 技術(shù)從鯉魚肌肉中克隆得到M M P ．2 的e D N A 全長共2 7 8 9b p ，開放閱讀框共1 9 7 1 b p ，編碼6 5 7 個氨基酸殘基。鯉魚M M P ．2 含有四個保守的結(jié)構(gòu)域，包括N 端含2 9 個氨基酸殘基的信號肽、前肽結(jié)構(gòu)域、含有三個重復(fù)I I型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域的催化結(jié)構(gòu)域以及C 端的類血紅素結(jié)構(gòu)域。利用空間預(yù)測軟件S w i s s ．m o

5、d e l ，對鯉魚M M P ．2 進(jìn)行同源建模，預(yù)測其三級結(jié)構(gòu)。M M P ．2 三級結(jié)構(gòu)為單體形式并有明顯的催化區(qū)、纖連蛋白結(jié)合區(qū)和類血紅素結(jié)合區(qū)等結(jié)構(gòu)域。其次，根據(jù)M M P ．2 的結(jié)構(gòu)特點，在大腸桿菌中表達(dá)由3 5 1 個氨基酸殘基組成的M M P ．2催化結(jié)構(gòu)域。S D S ．P A G E 表達(dá)分析鑒定，重組M M P ．2 分子量約為3 8k D a ，且以包涵體的形式表達(dá)。利用H i s 標(biāo)簽親和層析技術(shù)，在變性條件

6、下進(jìn)一步純化重組M M P ．2 蛋白。通過透析復(fù)性后，利用明膠酶譜檢測，結(jié)果顯示重組M M P ．2 具有較強(qiáng)分解明膠的活性。進(jìn)一步研究表明，重組M M P ．2 在p H 6 ．0 ．9 ．0 范圍內(nèi)都表現(xiàn)出不同程度的降解I 型膠原蛋白的活性，但在p H8 ．0 時活性最高。重組M M P ．2 在2 0 0 C ．3 0 0 C 下有較弱的活性，在3 5 0 C- 4 5 0 C 溫度范圍內(nèi)活性較高，4 0 0 C 時活性最高。金

7、屬蛋白酶抑制劑E D T A 、E G T A 和1 ，10 - p h e n a n t h r o l i n e 對該酶有較強(qiáng)的抑制作用，而其他類型的蛋白酶抑制劑如絲氨酸蛋白酶抑制劑b e n z a m i d i n e 、P M S F 、l e u p e p t i n ，半胱氨酸蛋白酶抑制劑E ．6 4 ，天冬氨酸蛋白酶抑制劑p e p s t a t i n A 對重組M M P ．2 活性無明顯的抑制作用。c a

8、 ：+ 能夠顯著增強(qiáng)重組M M P ．2 的活性，表明該酶為C a ：+ 依賴型金屬蛋白酶。重組M M P ．2 不僅在3 7 0 C ，甚至在4 0 C 都可以有效降解鯉魚肌肉I 型膠原蛋白，證實了M M P ．2 參與魚體死后的肌肉軟化功能。然而，重組M M P ．2 對鯉魚肌原纖維蛋白沒有降解作用，推斷在生理條件下M M P 一2 不以肌原纖維蛋白為底物，是特異性降解膠原蛋白的明膠酶。另外，本研究還對M M P ．2 催化結(jié)構(gòu)域中