皺紋盤鮑基質(zhì)金屬蛋白酶基因的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)是一類鋅離子依賴型內(nèi)肽酶，屬于金屬蛋白酶類。MMPs的主要底物膠原蛋白是動(dòng)物肌肉的重要組成成分，因此，MMPs參與肌肉蛋白新陳代謝，與肌肉質(zhì)構(gòu)變化密切相關(guān)。貝類是我國重要經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)動(dòng)物，但目前貝類MMPs基因的存在形式及MMPs與肌肉蛋白的相互作用關(guān)系卻鮮有報(bào)道。本研究以皺紋盤鮑(Haliotis discus hanai)為研究對(duì)象，采用分子生物學(xué)技術(shù)克隆得到

2、MMPs基因序列并利用大腸桿菌及畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)重組蛋白的異源表達(dá)，對(duì)MMPs在皺紋盤鮑不同組織中的相對(duì)表達(dá)量及其與鮑魚肌肉蛋白的相互作用進(jìn)行了初步研究。
　　首先，利用同源克隆及RACE技術(shù)從皺紋盤鮑肌肉中克隆得到MMP-1(Hdh-MMP-1)及MMP-2(Hdh-MMP-2)基因cDNA序列。Hdh-MMP-1(GenBank登錄號(hào)KR537291.1)cDNA全長(zhǎng)2136 bp，其中開放閱讀框(ORF)1551bp，編

3、碼516個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量58.94 kDa，理論等電點(diǎn)為5.99，其含有MMP家族典型的前肽區(qū)、催化區(qū)、鉸鏈區(qū)及類血紅素結(jié)合區(qū)。BLAST結(jié)果顯示，Hdh-MMP-1與多種鮑類MMP-1、某些軟體動(dòng)物和蟲類MMPs氨基酸序列相似。Hdh-MMP-2(GenBank登錄號(hào)KX058128.1)基因1644 bp，預(yù)測(cè)分子量61.66 kDa，理論等電點(diǎn)為5.19，除MMP家族典型的區(qū)域外，還含有明膠酶特有的II型纖連蛋白結(jié)合區(qū)。Hdh

4、-MMP-2與多種無脊椎軟體動(dòng)物及哺乳動(dòng)物MMP-2具有序列相似性，表明該基因在不同物種間較保守。SOPMA預(yù)測(cè)結(jié)果顯示Hdh-MMPs二級(jí)結(jié)構(gòu)元件均含α螺旋結(jié)構(gòu)，β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，延伸鏈及無規(guī)卷曲。此外，分別以人MMP-1、大西洋鮭MMP-2作為建模模板，模擬了Hdh-MMPs的三級(jí)結(jié)構(gòu)。
　　其次，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒 pET-cMMP-1，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)并純化得到重組 Hdh-cMMP-1，將其用于制備特異兔抗鮑魚 MM

5、P-1多克隆抗體。同時(shí)，利用畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)分子量約為90 kDa的重組Hdh-MMP-1，明膠酶譜結(jié)果顯示該蛋白具有降解明膠的生物活性。進(jìn)一步構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒 pET-cMMP-2及融合表達(dá)質(zhì)粒MBP-cMMP-2并轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)宿主，成功誘導(dǎo)表達(dá)并純化得到以包涵體形式及可溶形式表達(dá)的重組Hdh-cMMP-2。但兩種表達(dá)方式獲得的目的蛋白均無生物活性，此后對(duì)重組蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并且與重組刺參MMP-2蛋白進(jìn)行比較。

6、r>　　最后，利用熒光定量PCR研究了Hdh-MMPs基因在皺紋盤鮑不同組織中表達(dá)量差異，結(jié)果顯示，Hdh-MMPs基因在所檢測(cè)的各組織中均有不同程度表達(dá)，且在血細(xì)胞及腮等免疫相關(guān)組織中表達(dá)量最高，表明 Hdh-MMPs在皺紋盤鮑免疫調(diào)控環(huán)節(jié)具有一定生物功能。用致病菌副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)感染皺紋盤鮑，研究感染前后肌肉質(zhì)構(gòu)變化及 Hdh-MMPs基因相對(duì)表達(dá)量變化情況。結(jié)果顯示，一次染菌后鮑魚肌肉