菌寄生真菌纖細齒梗孢蛋白酶基因克隆與表達.pdf

1、生物之間的相互識別及信號傳導一直以來都是生命科學研究的重要領域。菌寄生真菌與其寄主之間的相互作用是自然界普遍存在的一種生命現(xiàn)象。我們可以通過研究菌寄生真菌與寄主之間的相互作用來揭示生物之間的相互作用的分子機制。纖細齒梗孢(Olpitrichum tenellum)是一種活體營養(yǎng)接觸型菌寄生真菌,其寄主包括Fusarium moniliforme,Alternaria alternata等。我們實驗室一直在努力以其為基礎研究菌寄生真菌與寄

2、主真菌之間的相互作用的分子機制。細胞壁是細胞和細胞之間相互作用的第一道屏障,細胞壁蛋白研究已經成為生物間相互識別機制研究的熱點。近年來,菌寄生真菌蛋白酶在菌寄生過程中的作用被人們逐漸重視起來?？寺『捅磉_菌寄生真菌的蛋白酶編碼基因變得很有意義。 絲氨酸蛋白酶是一類以絲氨酸為活性中心的重要的蛋白水解酶。在生物體中絲氨酸蛋白酶超家族成員執(zhí)行多種多樣的生理功能,在很多致病過程以及細胞內的信號轉導等方面起著重要作用。通過分析絲狀真菌絲氨酸

3、蛋白酶氨基酸序列,我們發(fā)現(xiàn)絲狀真菌絲氨酸蛋白酶催化區(qū)的氨基酸序列非常保守。根據(jù)絲狀真菌絲氨酸蛋白酶的同源保守序列設計兼并引物,通過RT-PCR及快速擴增cDNA末端(RACE)的方法,克隆了該蛋白酶的編碼基因mppro,全長cDNA包含3’、5’非編碼區(qū)為2024bp,包含一個1554bp的ORF,編碼517個氨基酸,該基因在GenBank中注冊的登記號為EU368754。 通過生物信息學的方法對獲得的蛋白酶的編碼基因mppro

4、的核苷酸序列及推導的氨基酸序列進行了序列分析,通過分析發(fā)現(xiàn)mppro編碼的蛋白是一種分泌型的絲氨酸蛋白酶,它屬于與絲氨酸蛋白酶S8家族的枯草桿菌蛋白酶subtilisin,具有典型的信號肽-前肽-成熟肽的結構,并且和菌寄生真菌較多的木霉屬真菌絲氨酸蛋白酶相似性很高,這可能是因為其都為菌寄生真菌有關。 將經EcoR I和Not I雙酶切的mppro基因和原核表達載體pET-22b(+)進行連接,構建成原核表達載體pET/mppro

5、,并轉化大腸桿菌E. coli BL21。經IPTG誘導培養(yǎng)4～5h,目的蛋白得到大量表達,SDS-PAGE電泳檢測,在約31kDa處有一條明顯的蛋白帶；而空質粒pET-22b(+)轉化BL21經誘導培養(yǎng)后無相應蛋白產生。原核表達后的蛋白沒有活性,可能由于表達的蛋白以包涵體形式出現(xiàn)。 mppro基因和酵母分泌型表達載體pPIC9K雙酶切后體外連接,構建酵母重組表達載體pPIC9K/mppro并測序,保證正確的閱讀框。將重組表達質

6、粒pPIC9K/mppro和pPIC9K空質粒分別用限制性內切酶Xba I(位于HIS4區(qū)內)線性化后,采用電擊法轉化Pichia pastoris GS115酵母感受態(tài)細胞,于MD/MM平板上篩選His+Mut+表型的酵母轉化子。經過PCR檢測篩選整合子,進行甲醇誘導培養(yǎng),甲醇誘導5d酶活性達到最高,達153U/mL。SDS-PAGE電泳檢測,在約39kDa處有一條明顯的蛋白帶,蛋白大小與從該蛋白酶氨基酸序列估計的蛋白分子量相符；對轉