重組五步蛇毒降纖酶的基因克隆、表達(dá)、純化及降纖研究.pdf

1、目的： 血漿纖維蛋白原是一種急性期反應(yīng)蛋白質(zhì)，在體內(nèi)易受遺傳和環(huán)境等多種因素的影響，例如：纖維蛋白原某些基因位點的改變(遺傳因素)，以及吸煙、手術(shù)或外傷、炎癥、感染、AMI等應(yīng)激情況(環(huán)境因素)均可使血漿纖維蛋白原水平反應(yīng)性升高。近年來，大量臨床和流行病學(xué)研究資料亦進一步證實了血漿纖維蛋白原水平升高是血栓性疾病的一個誘發(fā)因素，適當(dāng)降低血漿纖維蛋白原對于預(yù)防心腦血管血栓性疾病是十分重要的，特別是對于高危個體狀態(tài)下高纖維蛋白原血癥的

2、效果更加顯著。 本課題組在以往的研究發(fā)現(xiàn)，我國獨有的五步蛇毒中含有直接降解纖維蛋白原的成分。臨床上常用的降纖酶是從蛇毒毒素中提取的蛋白質(zhì)，由于自然來源的蛇毒成分與生物活性存在著地域性、季節(jié)性變異，實際上難以取得穩(wěn)定的臨床療效；粗制品蛇毒中成分復(fù)雜，雖經(jīng)純化處理，仍難獲得真正單一的化學(xué)成分，使臨床應(yīng)用中存在毒副作用；而且自然蛇毒產(chǎn)量有限，成本較高等缺點，引導(dǎo)研究方向轉(zhuǎn)向用基因工程技術(shù)。目前，基因工程藥物主要從大腸桿菌和酵母真核細(xì)胞

3、中表達(dá)得到，大腸桿菌中表達(dá)的目的蛋白是以包涵體形式存在且無糖基化。甲醇營養(yǎng)型酵母作為一種新型外源基因表達(dá)系統(tǒng)，兼有原核細(xì)胞良好的可操作性和真核系統(tǒng)的翻譯后加工的雙重特點，是外源基因表達(dá)的理想宿主，本實驗?zāi)康氖窃诋叧嘟湍钢袠?gòu)建表達(dá)五步蛇毒降纖酶基因，為基因工程降纖酶的生產(chǎn)探索一種新方法，并研制開發(fā)出可高活性地降解纖維蛋白原的重組降纖酶，并將其開發(fā)成具有完全自主知識產(chǎn)權(quán)的Ⅰ類新型基因工程藥物。 方法與結(jié)果： 1.五步蛇毒降纖

4、酶基因的克隆 本實驗通過五步蛇毒降纖酶抗體篩選五步蛇毒腺cDNA文庫得到陽性克隆，進行測序和同源性分析確定為降纖酶基因，PCR擴增降纖酶基因(FibrinogenaseⅣ，F(xiàn)Ⅳ)，將FⅣ與質(zhì)粒pPIC9K進行重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，進行篩選鑒定。經(jīng)過酶切和DNA序列測定，證實FⅣ基因正確插入pPIC9K質(zhì)粒中，成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-FⅣ。 2.五步蛇毒降纖酶基因在畢赤酵母中的表達(dá) 用SacI線形化

5、pPIC9K-FⅣ重組質(zhì)粒，并用電穿孔法轉(zhuǎn)染畢赤酵母KM71菌株，篩選和鑒定His+Muts轉(zhuǎn)化子，提取酵母基因組DNA，PCR檢測目的基因的整合，并進行表達(dá)和產(chǎn)物免疫印記鑒定，對FibrinogenaseⅣ基因表達(dá)結(jié)果進行初步分析，證實27kDa蛋白條帶為重組五步蛇毒降纖酶(recombinationFibrinogenaseⅣ，rFⅣ)。 3.基因重組降纖酶的發(fā)酵、純化及理化分析 在30升發(fā)酵罐上進行高密度培養(yǎng)發(fā)酵試

6、驗，對發(fā)酵工藝進行考察，發(fā)酵過程中酵母細(xì)胞濕重達(dá)到200-300g/L，實現(xiàn)高密度發(fā)酵的目的，經(jīng)過36小時的甲醇誘導(dǎo)，表達(dá)產(chǎn)物活性達(dá)到最高。表達(dá)產(chǎn)物分別用離子交換層析和疏水層析進行純化。對純化產(chǎn)物進行等電點和糖基化檢測，初步證實它為非糖基化的、等電點為7.1的重組蛋白。 4.基因重組降纖酶的酶學(xué)研究 本實驗我們研究了酶活性在不同影響因素下的作用，發(fā)現(xiàn)基因重組降纖酶rFⅣ在30-50℃的溫度處理15分鐘后，相對活性仍然維持

7、在80％以上；同時rFⅣ在pH4.5到11，相對活性維持在80％以上水平；一價金屬陽離子對rFⅣ的活性沒有影響，二價重金屬離子(Zn2+、Cu2+和Cd2+)在1mM濃度時對rFⅣ的活性都產(chǎn)生了明顯抑制作用，并隨著濃度增加抑制作用更加明顯；L-cysteine、PMSF、EDTA和DTT都可以不同程度的抑制rFⅣ的酶活性。與發(fā)色底物(N-(p-Tosyl)-Gly-Pro-Lys4-pNA)共同孵育測得的Km值是7.471×10-4mo

8、l/L，Vmax值是5.103×10-5mol/s。rFⅣ可降解纖維蛋白原的Aα、Bβ和γ鏈，這種降解作用隨著時間和濃度的增加而增強。 5.基因重組降纖酶對高纖維蛋白原血癥大鼠模型的降纖作用 為了衡量rFⅣ的急性毒性的大小，我們先測定了rFⅣ的半數(shù)致死量(LD50)，結(jié)果為LD50=62.76mg/kg。利用高纖維蛋白原血癥模型研究了rFⅣ在整體動物上的降纖作用，結(jié)果顯示高、中、低劑量rFⅣ均具有明顯降低高纖維蛋白原血癥

9、大鼠模型的血漿纖維蛋白原作用，且這種作用隨著劑量增加而增強。 結(jié)論： 1.本研究構(gòu)建了pPIC9K-FⅣ重組質(zhì)粒，并成功實現(xiàn)了基因重組降纖酶rFⅣ在畢赤酵母中的表達(dá)。為生產(chǎn)過程和臨床應(yīng)用提供了實驗基礎(chǔ)。 2.實驗中構(gòu)建篩選了Muts表型的FⅣ/KM71畢赤酵母表達(dá)菌株，可實現(xiàn)短時間、高密度、大規(guī)模發(fā)酵表達(dá)，并對其純化工藝進行了研究，這對實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)有重要意義。 3.rFⅣ在高纖維蛋白原血癥整體動物模型中