降纖酶的質(zhì)量分析及其方法研究.pdf

1、本文以尖吻蝮蛇和白眉蝮蛇降纖酶為研究對(duì)象，分別采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法測(cè)定肽圖譜、等電聚焦（IEF）電泳法測(cè)定等電點(diǎn)、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法鑒別不同蛇毒來源的降纖酶對(duì)纖維蛋白原的作用方式；RP-HPLC法檢查降纖酶純度、測(cè)定注射用降纖酶的含量，纖維蛋白原凝固法測(cè)定降纖酶活性。SDS-PAGE法和基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）法測(cè)定分子量，異硫氰酸苯酯（PITC）

2、柱前衍生化法測(cè)定氨基酸組成，Edman降解法測(cè)定N末端序列，正相高效液相色譜法（NP-HPLC）測(cè)定 N-連接寡糖譜，高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)（HPAEC-PAD）法測(cè)定糖鏈中的單糖組成。并對(duì)國(guó)內(nèi)多家生產(chǎn)企業(yè)的注射用降纖酶進(jìn)行檢測(cè)分析，初步探討了降纖酶含量與活性的相關(guān)性，提出了對(duì)現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的修訂意見。
　　研究及分析結(jié)果表明，尖吻蝮蛇降纖酶和白眉蝮蛇降纖酶經(jīng)胰蛋白酶酶解后，RP-HPLC肽圖譜存在明顯差異；等電點(diǎn)分別為3

3、.5和4.5-8.0；尖吻蝮蛇降纖酶作用于纖維蛋白原的α鏈，而白眉蝮蛇降纖酶作用于α和β鏈；RP-HPLC法可以用于降纖酶的純度檢查及注射用降纖酶的含量測(cè)定；血凝儀代替目測(cè)判斷降纖酶活性測(cè)定反應(yīng)終點(diǎn)完全可行。MALDI-TOF-MS測(cè)得尖吻蝮蛇降纖酶和白眉蝮蛇降纖酶分子量分別為33363.95和33633.75，SDS-PAGE法測(cè)得兩種蛇毒來源的降纖酶分子量均為40kD；兩種蛇毒來源的降纖酶氨基酸組成相同，每種氨基酸的個(gè)數(shù)略有差別；其

4、N末端序列的第五位和第八位氨基酸存在差異；寡糖譜也存在明顯不同；寡糖鏈中均含有巖藻糖（Fuc）、甘露糖（Man）、半乳糖（Gal）、N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和唾液酸（NeuNAc），尖吻蝮蛇降纖酶的上述單糖總量達(dá)22.0％（w/w），略高于白眉蝮蛇降纖酶（19.0%）。各企業(yè)注射用降纖酶的RP-HPLC色譜圖差別較大，用高效凝膠過濾色譜（HPSEC）法未檢出聚合物，酶活性與RP-HPLC色譜圖中的主峰面積在一定范圍內(nèi)有正相關(guān)性，

5、與HPSEC色譜圖中的主峰呈一定趨勢(shì)分布。在擬修訂的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中新增4項(xiàng)專屬性較強(qiáng)的鑒別方法及原料的純度檢查法，改進(jìn)了酶活性測(cè)定方法。
　　本研究針對(duì)現(xiàn)有降纖酶及其制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的不足，研究建立的RP-HPLC肽圖譜法、基于降纖酶對(duì)纖維蛋白原作用方式的SDS-PAGE法等專屬性強(qiáng)的鑒別方法，以及降纖酶RP-HPLC純度檢查法等在國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道；首次對(duì)比研究了尖吻蝮蛇降纖酶和白眉蝮蛇降纖酶的氨基酸組成、寡糖譜及單糖組成，規(guī)范了降纖酶的相