牛乳鐵素基因的克隆及在大腸桿菌和畢赤酵母中的表達(dá).pdf

1、乳鐵蛋白(LF)是一種具有多種生物學(xué)功能的天然活性鐵結(jié)合糖蛋白，在殺菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等方面起重要作用，是調(diào)節(jié)動(dòng)物體液中自由鐵離子水平的轉(zhuǎn)鐵家族中最重要的成員。天然乳鐵蛋白主要存在于動(dòng)物乳汁尤其是人初乳中，含量可達(dá)6-8mg/mL。乳鐵素是乳鐵蛋白在酸性條件下經(jīng)蛋白酶消化后從N-端釋放出來(lái)的一個(gè)小肽段，并且抗菌活性強(qiáng)于乳鐵蛋白。國(guó)外對(duì)牛乳鐵素、人乳鐵素、山羊乳鐵素、鼠乳鐵素等的抗菌活性進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)牛乳鐵素的抗菌活性最強(qiáng)。牛乳鐵

2、素(LfcinB)作為一種廣譜高效的抗菌肽，在替代傳統(tǒng)抗生素研究中顯示了巨大的潛力和廣闊的應(yīng)用前景。由于自然界中的LfcinB資源有限，提取成本高，本試驗(yàn)擬通過(guò)基因工程技術(shù)建立一個(gè)體外高效表達(dá)系統(tǒng)，以期為大量獲得LfcinB并進(jìn)行深入研究奠定基礎(chǔ)。 本試驗(yàn)根據(jù)GenBank中已報(bào)道的BLF基因(NO∶NM_180998)，化學(xué)合成LfcinB的單鏈基因序列。以合成的序列為模板，用相應(yīng)的特異性引物擴(kuò)增LfcinB基因。結(jié)果表明擴(kuò)增

3、得到的PCR產(chǎn)物濃度高、特異性強(qiáng)，且大小在92bp左右。將PCR產(chǎn)物直接克隆到pMD18-T載體上，經(jīng)過(guò)菌落PCR鑒定和BamHⅠ/SalⅠ限制性內(nèi)切酶酶切分析，初步確認(rèn)目的基因已克隆入T載體。將含重組質(zhì)粒的菌液送上海生物工程公司測(cè)序，結(jié)果與本試驗(yàn)所合成的單鏈基因序列同源性為100％，表明擴(kuò)增得到的是LfcinB基因。 PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后用EcoRⅠ、NotⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，膠回收獲得連接用LfcinB基因片段。將原

4、核表達(dá)載體pET-22b(+)和真核表達(dá)載體pPIC9K分別用EcoRⅠ、NotⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，然后膠回收目的片段。 將酶切的PCR產(chǎn)物與酶切的原核表達(dá)載體pET-22b(+)連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，加入IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)，分別收集誘導(dǎo)2h、3h、4h的菌液。同時(shí)設(shè)一個(gè)不加IPTG誘導(dǎo)的空白對(duì)照和一個(gè)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的非重組菌對(duì)照。經(jīng)菌落PCR鑒定、酶切分析確認(rèn)LfcinB基因已經(jīng)插入了多克隆位點(diǎn)。

5、表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果在約3.2KD的位置有目的條帶，而對(duì)照組沒(méi)有出現(xiàn)這條帶，表明目的蛋白得到了表達(dá)，且誘導(dǎo)3h的表達(dá)量最高。 將酶切的PCR產(chǎn)物與酶切的真核表達(dá)載體pPIC9K連接，用SalⅠ線性化重組質(zhì)粒，并通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞。用G418濃度分別為0.5、0.75、1.0、1.5mg/mL的YPD平板篩選多拷貝His+轉(zhuǎn)化子，再通過(guò)多拷貝His+轉(zhuǎn)化子在MM和MD板上的生長(zhǎng)情況進(jìn)

6、一步確定轉(zhuǎn)化子的表型，最后誘導(dǎo)目的基因在畢赤酵母中的分泌表達(dá)。收集的上清經(jīng)冷凍干燥濃縮后進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果在分子量約為3.2KD的位置有目的產(chǎn)物的帶，而對(duì)照組沒(méi)有出現(xiàn)這條帶，表明該菌株可以表達(dá)目的蛋白，但目的蛋白的條帶是經(jīng)過(guò)濃縮后才被SDS-PAGE檢測(cè)到，表明表達(dá)的目的蛋白的量不是很理想。將上清液按同樣方法濃縮，用本實(shí)驗(yàn)室保存的大腸桿菌對(duì)濃縮產(chǎn)物做抑菌試驗(yàn)，初步鑒定其抗菌活性，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照。結(jié)果陰性對(duì)照孔沒(méi)有抑菌圈，試驗(yàn)