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文檔簡介
1、目的：構(gòu)建降鈣素原(PCT)基因的原核表達載體,并在大腸桿菌中進行表達,以獲取高產(chǎn)量、低成本、高純度的PCT蛋白。 方法：按人的全長PCT cDNA序列,設(shè)計引物用標準的PCR法全基因合成步驟合成扣除信號肽外PCT的片段,應(yīng)用基因重組技術(shù)將該片段克隆到質(zhì)粒pET21a(+)中,進行限制性內(nèi)切酶酶切分析和DNA測序鑒定。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli(DH5a),經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達后,用Ni-
2、NTA親和層析純化獲取蛋白,用SDS-PAGE和western blot的方法鑒定。 結(jié)果：擴增出的人PCT片段于原核表達載體中克隆,經(jīng)酶切和核酸測序鑒定,得到正確的重組質(zhì)粒pET-PCT,并在大腸桿菌中得以表達。純化后的蛋白經(jīng)考馬氏亮藍染色呈單一條帶；用抗PCT的抗體進行Western blot分析證明目的蛋白有反應(yīng)性。 結(jié)論：本研究成功構(gòu)建了表達基因重組人PCT的原核表達載體,基因重組人PCT蛋白在大腸桿菌中獲得了表
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