重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子在大腸桿菌中的表達(dá)、純化和性質(zhì)研究.pdf

1、本研究利用橋式PCR技術(shù)克隆了人CNTF(humanCNTFhCNTF)基因，并構(gòu)建了缺失了C末端15個氨基酸的突變體hCNTF重組質(zhì)粒，表達(dá)的重組蛋白命名為rhCNTF(recombinanthumanciliaryneurotrophicfactor)。通過表達(dá)載體的選擇、工程菌的篩選、表達(dá)條件的優(yōu)化等過程，以實現(xiàn)rhCNTF的高效表達(dá)。隨后經(jīng)包涵體復(fù)性及純化，獲得高純度的蛋白。最后對獲得的rhCNTF進(jìn)行理化性質(zhì)的研究，包括：分子

2、量測定、純度分析、免疫原性測定、紫外吸收分析、等電點分析、氨基酸組分分析、肽圖分析、N端測序等。 結(jié)果表明，用溫度誘導(dǎo)型載體表達(dá)rhCNTF的效果較好。篩選到的工程菌在30℃培養(yǎng)至菌密度為A550=0.8-1.4時，置于42-44℃下誘導(dǎo)4h，rhCNTF表達(dá)量最高，達(dá)菌體總蛋白量的50％以上，獲得了高效表達(dá)。經(jīng)1％TritonX-100和2M尿素漂洗包涵體、稀釋法和透析法復(fù)性、一步Q-Sephrose層析純化等步驟，得到純度高

3、達(dá)99％以上的rhCNTF。最終每升菌液可獲得高純度的rhCNTF蛋白約50mg。rhCNTF理化指標(biāo)的鑒定結(jié)果顯示：分子量為21112.32Da；純度約達(dá)99％；rhCNTF具有類似天然CNTF的抗原性；最大吸收峰為279.9nm；等電點為3.99；氨基酸組成分析與理論值基本一致；肽圖分析rhCNTF與理論rhCNTF匹配；N末端15個氨基酸與理論rhCNTFN端2-16位的氨基酸序列一致。 本研究建立了一種簡單、廉價、高效的