大腸桿菌xylA和xylB基因的克隆與表達(dá).pdf_第1頁
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文檔簡介

1、隨著人們對全球性能源危機(jī)認(rèn)識的不斷加深及環(huán)境保護(hù)意識的不斷加強(qiáng),開發(fā)新的替代能源已是刻不容緩的重大戰(zhàn)略問題。生物乙醇作為一種可再生的替代能源,日益受到各國的重視。如何利用廉價生物質(zhì)等可再生資源進(jìn)行生物乙醇生產(chǎn)已成為各國的研究熱點之一。 本中心在這樣的背景下進(jìn)行Zymomonasmobilis基因工程改造,使其能發(fā)酵木糖生產(chǎn)乙醇。本文研究內(nèi)容為中心大課題的一部分,即克隆并表達(dá)大腸桿菌木糖異構(gòu)酶基因(xylA)與木酮糖激酶基因(xy

2、lB)。 首先通過紫外誘變、Ap富集與X-EMB平板篩選得到木糖營養(yǎng)缺陷型菌株787。通過PCR反應(yīng)克隆大腸桿菌K12xylAB,PCR產(chǎn)物以pBSKS(+)為載體引入菌株787,經(jīng)篩選平板篩選和轉(zhuǎn)化子酶活測定判斷克隆得到的DNA片段即為目的片段xylAB。測序結(jié)果進(jìn)一步證明克隆得到的DNA片段為目的片段xylAB。然后將xylAB與穿梭質(zhì)粒pZB1相連構(gòu)建成pZB1-xylAB質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化DH5α與Z.mobilisCP4。最

3、后,利用PCR重疊延伸技術(shù)將大腸桿菌xylAB自身的啟動子換成Z.mobilisCP4的gap基因的啟動子,構(gòu)建成pZB1-Pgap-xyIAB,并分別轉(zhuǎn)化DH5α與Z.mobilisCP4。 通過半胱氨酸-咔唑的方法測定菌株粗酶液的XI酶活,D-木酮糖-NADH耦聯(lián)法測定XK酶活,結(jié)果表明:大腸桿菌DH5α(pZB1-xylAB)XI酶活為DH5α(pZB1)的2倍,而XK酶活為DH5α(pZB1)的100倍,DH5α(pZB

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