大腸桿菌耐藥基因acrA、acrR的克隆與表達(dá)菌株的初步篩選.pdf

1、目前由于抗生素在大腸桿菌病防治過程中的長期、廣泛、不合理應(yīng)用，大腸桿菌耐藥特別是多重耐藥現(xiàn)象已十分嚴(yán)重，由耐藥菌株引起的人及動物感染性疾病不斷增加。大腸桿菌的多重耐藥主要與其主動外排系統(tǒng)的超量表達(dá)有關(guān)，主動外排系統(tǒng)的超量表達(dá)可引起細(xì)菌對多種抗生素高頻率、高水平耐藥。AcrAB-TolC外排泵是大腸桿菌最主要的主動外排系統(tǒng)，若使該系統(tǒng)失活，大腸桿菌可從多重耐藥狀態(tài)變?yōu)橄鄬γ舾袪顟B(tài)。AcrAB-TolC包括藥物質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)子AcrB、間質(zhì)融合蛋

2、白AcrA和外膜通道蛋白TolC，其表達(dá)水平受多種調(diào)控因子的調(diào)節(jié)，如AcrR、MarA、MppA、SdiA、Rob和SoxS等。其中AcrR為一負(fù)向調(diào)控子，主要調(diào)控AcrAB-TolC外排泵在最低水平表達(dá)。 本實(shí)驗(yàn)首先選取大腸桿菌藥敏質(zhì)控株ATCC25922及5株臨床分離的不同動物源性大腸桿菌，分別以其染色體DNA為模板，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增出大腸桿菌多重耐藥基因acrA和大腸桿菌多重耐藥調(diào)控基因acrR基因片段，將擴(kuò)增片段分別與

3、克隆載體pMD18-T simple Vector連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中，對經(jīng)KpnⅠ、XbaⅠ酶切與PCR反應(yīng)鑒定為陽性的克隆質(zhì)粒進(jìn)行插入片段的核苷酸序列測定。測序結(jié)果表明：不同源性大腸桿菌的acrA基因與acrR基因核苷酸序列及所推導(dǎo)的氨基酸序列與GeneBank中該基因序列的同源性較高，acrA基因核苷酸序列及所推導(dǎo)的氨基酸序列與GeneBank中該基因序列的同源性分別為99.1～100％，99.7～1

4、00％； acrR基因核苷酸序列及所推導(dǎo)的氨基酸序列與GeneBank中該基因序列的同源性分別為98.2～100％，98.6～100％。 在對acrA基因和acrR基因的克隆以及序列同源性比較分析的基礎(chǔ)上，將重組質(zhì)粒pMD18-T-acrA、pMD18-T-acrR與表達(dá)載體質(zhì)粒pPICZcαA分別用KpnⅠ、XbaⅠ酶切后構(gòu)建成表達(dá)重組質(zhì)粒pPICZαA-acrA、pPICZαA-acrR，分別將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)畢赤酵母宿主

5、菌GS115中，煮-凍-煮法提取重組酵母基因組，PCR法進(jìn)行陽性基因整合酵母的篩選，1％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示acrA、acrR基因已整合入GS115染色體上，PCR產(chǎn)物的分子量分別約為1.8Kb、1.2Kb。 本試驗(yàn)獲得的臨床分離的不同源性大腸桿菌耐藥基因acrA、大腸桿菌多重耐藥調(diào)控基因acrR進(jìn)行核苷酸與氨基酸序列同源性比較分析的結(jié)果，可為深入研究其AcrAB-TolC外輸泵的調(diào)控機(jī)制提供參考；構(gòu)建好的acrA、acrR基