22280.豬腸激酶催化亞基基因的克隆及其在畢赤酵母和大腸桿菌中的表達(dá)

1、分類號(hào)：Q2墨密級(jí)：公玨單位代碼：學(xué)號(hào)：!QQ墨魚至QQ墨!Q!豬腸激酶催化亞基基因的克隆及其在畢赤酵母和大腸桿菌中的表達(dá)J1’‘1●n●l●UloningandeXPresslonolPorclnecatalytic一l●n●■●oSUbunit0tenterokinasegenelnt，zC以Z口pastorisandEcon學(xué)位申請(qǐng)人：指導(dǎo)教師：學(xué)科專業(yè)：學(xué)位類別：授予單位：答辯日期：劉龍飛仲飛教授微生物與生化藥學(xué)理學(xué)碩士河北農(nóng)業(yè)

2、大學(xué)二。一一年六月四日摘要I／llPlflflIIIIIUfIIIJrrlflrfJIIFY1897044腸激酶(Enterol(inause，EK)是哺乳動(dòng)物十二指腸上皮產(chǎn)生的一種異源二聚體絲氨酸蛋白酶，由1條重鏈和l條輕鏈組成，酶的催化活性部位于輕鏈上。EK是蛋白酶類中專一性較高的一種酶，它能夠?qū)Ｒ恍宰R(shí)別蛋白質(zhì)分子中由連續(xù)4個(gè)天冬氨酸和1個(gè)賴氨酸與下一個(gè)任意氨基酸組成的肽段，并能水解由賴氨酸與任意氨基酸形成的肽鍵，即DDDDK’【X

3、(X代表任意氨基酸)。用EK切割融合蛋白不僅能夠確保其它部位的肽鍵不被破壞，同時(shí)切割后所釋放的目的多肽具有和野生型完全一致的N末端氨基酸序列，因此EK作為蛋白表達(dá)體系中融合蛋白的切割試劑被廣泛利用。市售的腸激酶價(jià)格昂貴，本實(shí)驗(yàn)擬采用基因工程的方法制備具有生物活性的腸激酶。目前，多見關(guān)于牛腸激酶的研究，對(duì)豬腸激酶的的研究未見于報(bào)道。因此，本試驗(yàn)考慮到生產(chǎn)成本和重組蛋白活性等方面，對(duì)豬的腸激酶輕鏈分別采用畢赤酵母表達(dá)體系和原核表達(dá)體系進(jìn)行了

4、表達(dá)。首先，本試驗(yàn)對(duì)豬腸激酶催化亞基基因進(jìn)行了克隆并在畢赤酵母中進(jìn)行了表達(dá)。為制備重組豬腸激酶催化亞基(EKL)，依據(jù)GenBank豬EKL基因的編碼序列，通過RTPCR方法從豬小腸粘膜組織中擴(kuò)增EKLcDNA基因，利用SnaBI和NotI酶切位點(diǎn)，將該EKL片段插入到酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K質(zhì)粒中，并與載體中的a因子信號(hào)肽序列融合，構(gòu)建成EKL基因的分泌型酵母表達(dá)載體pPIC9KEKL。表達(dá)載體經(jīng)SalI線性化后，以電轉(zhuǎn)化的方法

5、將其轉(zhuǎn)移到組氨酸缺陷型的酵母宿主菌GSI15中。然后利用以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基(MD)和以甲醇為碳源的培養(yǎng)基(MM)篩選出組氨酸His型和甲醇利用正型(Mut)酵母重組體，再經(jīng)G418加壓篩選得到高拷貝豬EKL基因的重組酵母。經(jīng)PCR檢測(cè)證明EKL基因已整合到畢赤酵母的染色體中。重組酵母經(jīng)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)和甲醇誘導(dǎo)進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDSPAGE檢測(cè)及酶促活性檢測(cè)，結(jié)果顯示在酵母菌培養(yǎng)基中檢測(cè)到分子量為35kDa的重組EKL蛋白，經(jīng)過對(duì)制

6、備的胰蛋白酶原進(jìn)行酶促水解檢測(cè)，證明該重組EKL蛋白具有激活胰蛋白酶原的活性，表明本研究制備的重組豬EKL具有生物活性。考慮到生產(chǎn)成本及表達(dá)便捷程度等方面的因素，本試驗(yàn)用大腸桿菌BL21(DE3)對(duì)豬腸激酶催化亞基基因進(jìn)行了表達(dá)。采用PCR方法擴(kuò)增豬腸激酶輕鏈(EKL)基因，利用EcoRV和HindIII位點(diǎn)將豬EKL基因插入到原核表達(dá)載體pET20b()中，構(gòu)建成C端與Histag融合的EKL原核表達(dá)載體pET20bEKL。將表達(dá)載體