Tth DNA聚合酶基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、通過因特網(wǎng)從Genebank中找到Tth DNA聚合酶基因序列,利用Pinmer4軟件對其內(nèi)切酶位點進行分析,并設(shè)計了兩組引物進行PCR,分段克隆該基因,用PstI分別對PCR產(chǎn)物酶解,結(jié)果所得的DNA片段與計算機分析的完全一致.分別把兩個片段過接到pGEM-T質(zhì)粒上得pJYQ-T1和pJYQ-T2質(zhì)粒,用AflⅡ和SalI分別酶切pJYQ-T1,pJYQ-T2,回收純化所需片段進行連接,拼接成完整的TthDNA聚合酶基因,得到質(zhì)粒pJ

2、YQ-T3.以pJYQ-T3為模板,通過PCR擴增得TthDNA聚合酶基因.以Bg1Ⅱ和EcoRI酶切PCR產(chǎn)物,以BamHI和EcoRI酶切pET-5a,用T4 ligase把該基因連接到pET-5a上,并轉(zhuǎn)化BL21(DE3)pLysS.培養(yǎng)轉(zhuǎn)化了pET-5a:Tth的BL21(DE3)pLysS,加入IPTG誘導(dǎo),收集細胞并用溶酶破碎,用粗提液進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測表達蛋白的分子量大小,并以它作為酶源進行PCR,測定該

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