綠色木霉內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因的克隆及其在大腸桿菌中表達的研究.pdf

1、浙江工商大學碩士學位論文綠色木霉內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因的克隆及其在大腸桿菌中表達的研究姓名：章慧慧申請學位級別：碩士專業(yè)：食品科學指導教師：勵建榮于平20080301綠色木霉內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因的克隆及其在大腸桿菌中表達的研究Trichodermaspw512DQ4624151、TrichodermaV護Z出EF6354271、AF2088421、TrichodermaaureoviddeAY8500321和TrichodermahamatumU

2、885601同源性高達95％以上。3綠色木霉內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因編碼一酸性蛋白，等電點pI為495。預測編碼蛋白的氨基酸序列含424個氨基酸殘基，預測分子量為46kDa。綠色木霉內(nèi)切幾丁質(zhì)酶蛋白164172位氨基酸是幾丁質(zhì)酶18家族的活性位點，序列為FDGIDVDWE。用同源建模法模擬出綠色木霉內(nèi)切幾丁質(zhì)酶的空間結構?！汀?根據(jù)測序結果，設計兩對引物，擴增出帶綠色木霉內(nèi)切幾丁質(zhì)酶自身信號肽基因ECH和成熟的內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因MECH。利用載

3、體pET28a，構建原核表達載體pET28aECH和pET28aMECH。經(jīng)驗證分析表明，所克隆的?；駿CH和MECH已置于表達載體的正確閱讀密碼框下。5包含pET28aECH和pET28a—MECH重組菌經(jīng)誘導表達后經(jīng)SDS—PAGE分析，蛋白的分子量均為42kDa。通過對表達載體pET28a—ECH和pET28aMECH的SDSPAGE幾種參數(shù)包括時間、IPTG濃度誘導表達分析，結果顯示pET28a—ECH最佳誘導時間為3h，pE

4、T28a—MECH誘導時間3—4h時表達量最高；pET28aECH最佳誘導IPTG濃度為10mmol／L。用DNS法對表達載體pET28aECH署HpET28aMECH產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶粗酶液的酶活進行初步測定發(fā)現(xiàn)，表達載體pET28aMECH酶活高于pET28aECH。6通過對重組幾丁質(zhì)酶的生化性質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)，該酶的最適反應溫度為35℃，最適反應pH為70。酶的熱穩(wěn)定性不好，容易失活。添加低濃度(10mM)的金屬離子M92、Ba、Cu2、