綠色木霉內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因的克隆及其在大腸桿菌中表達(dá)的研究.pdf

1、浙江工商大學(xué)碩士學(xué)位論文綠色木霉內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因的克隆及其在大腸桿菌中表達(dá)的研究姓名：章慧慧申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：食品科學(xué)指導(dǎo)教師：勵(lì)建榮于平20080301綠色木霉內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因的克隆及其在大腸桿菌中表達(dá)的研究Trichodermaspw512DQ4624151、TrichodermaV護(hù)Z出EF6354271、AF2088421、TrichodermaaureoviddeAY8500321和TrichodermahamatumU

2、885601同源性高達(dá)95％以上。3綠色木霉內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因編碼一酸性蛋白，等電點(diǎn)pI為495。預(yù)測(cè)編碼蛋白的氨基酸序列含424個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)分子量為46kDa。綠色木霉內(nèi)切幾丁質(zhì)酶蛋白164172位氨基酸是幾丁質(zhì)酶18家族的活性位點(diǎn)，序列為FDGIDVDWE。用同源建模法模擬出綠色木霉內(nèi)切幾丁質(zhì)酶的空間結(jié)構(gòu)模‘型。4根據(jù)測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，擴(kuò)增出帶綠色木霉內(nèi)切幾丁質(zhì)酶自身信號(hào)肽基因ECH和成熟的內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因MECH。利用載

3、體pET28a，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28aECH和pET28aMECH。經(jīng)驗(yàn)證分析表明，所克隆的。基因ECH和MECH已置于表達(dá)載體的正確閱讀密碼框下。5包含pET28aECH和pET28a—MECH重組菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)SDS—PAGE分析，蛋白的分子量均為42kDa。通過(guò)對(duì)表達(dá)載體pET28a—ECH和pET28aMECH的SDSPAGE幾種參數(shù)包括時(shí)間、IPTG濃度誘導(dǎo)表達(dá)分析，結(jié)果顯示pET28a—ECH最佳誘導(dǎo)時(shí)間為3h，pE

4、T28a—MECH誘導(dǎo)時(shí)間3—4h時(shí)表達(dá)量最高；pET28aECH最佳誘導(dǎo)IPTG濃度為10mmol／L。用DNS法對(duì)表達(dá)載體pET28aECH署HpET28aMECH產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶粗酶液的酶活進(jìn)行初步測(cè)定發(fā)現(xiàn)，表達(dá)載體pET28aMECH酶活高于pET28aECH。6通過(guò)對(duì)重組幾丁質(zhì)酶的生化性質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)，該酶的最適反應(yīng)溫度為35℃，最適反應(yīng)pH為70。酶的熱穩(wěn)定性不好，容易失活。添加低濃度(10mM)的金屬離子M92、Ba、Cu2、