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文檔簡介
1、腎綜合征出血熱是一類危害較大的新現病毒性疾病,漢坦病毒是它的病原體,在中國以漢灘型和漢城型為主,其代表毒株分別為Z10株和L99株.在病毒的基因組中S基因所編碼的核蛋白是病毒的主要結構蛋白,構成病毒核衣殼的主要成分.核蛋白具有很強的抗原性及免疫原性,高度保守,患者對核蛋白的抗體應答不僅出現的早且滴度高.因此,核蛋白可以用作理想的診斷抗原.巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)表達系統是一種新型外源基因表達系統,兼有原核細胞良好的
2、可操作性和真核系統的后加工,表達基因插入整合在染色體上更為穩(wěn)定,且發(fā)酵條件簡單,適宜高密度培養(yǎng),具高效表達的優(yōu)勢,易于純化,為其產業(yè)化提供極大方便.該文分別從漢坦病毒漢灘型Z10株和漢城型L99株感染的Vero-E6細胞中提取總RNA,經RT-PCR擴增獲得全長S基因片段,插入pGEM-T-Easy載體中,經酶切鑒定及序列分析,證實了基因片段的正確插入.繼而,將重組質粒pGEM-T-Easy-Z10-S和pGEM-T-Easy-L99-
3、S中的外源片段插入畢赤酵母分泌表達載體pPICZα,經酶切鑒定及核苷酸序列分析證實重組質粒pPICZαA-Z10-S和pPICZαC-L99-S的讀碼框架正確,并經3D-PASSM server軟件分析預測目的蛋白空間結構無改變.重組質粒經SacI酶切線性化后導入畢赤酵母菌X-33進行插入整合,PCR鑒定證實S基因已插入酵母菌的染色體中,分別命名為Z10-S/X-33株和L99-S/X-33株.重組菌株經0.5%甲醇誘導表達,培養(yǎng)液上清
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