隔孢伏革菌植酸酶在畢赤酵母中的高效表達(dá)研究.pdf

1、2 揚(yáng)州大學(xué)碩士學(xué)位論文A b s t r a c tP h y t a s e ，a f e e da d d i t i v e ，c a ni m p r o v et h eu t i l i t yo f p h o s p h a t e i np l a n tf e e d s t u f f sa n dt h e a b s o r p t i o n o f n u t r i e n t s f o r m o

2、n o —g a s t r i c a n i m a l s ．I t c a na l s o r e d u c e t h ep h o s p h o r u sp o l l u t i o n i n e n v i r o n m e n t ．P h y t a s e h a sab r i g h t a n db r o a d a p p l i c a t i o np r o s p e c t sb e

3、 c a u s e t h a tf e e d i n ge f f e c t sh a d b e e n a c k n o w l e g e d ．H o w e v e r , t h e r ea r e t w om a j o r d r a w b a c k s t o a f f e c t t h e w i d eu s e o f p h y t a s e ：o n e i s t h e p h y

4、 t a s e l o w e rp r o d u c t i o n f o r w i l d - t y p e s t r a i n ；a n o t h e r i s t h e t h e r m o s t a b i l i t y t h a t a f f e c t t h ec o m m e r c i a lu s e ．T h e r e f o r e ，i n c r e a s i n gt

5、h ey i e l da n d i m p r o v i n gt h et h e r m o s t a b i l i t yp h y t a s e n e e df u r t h e r r e s e a r c h ．T h e6 - p h y Ag e n ew a sa r t i f i c i a l l y s y n t h e s i z e db a s e d o nc o d o np r

6、e f e r e n c e o fP i c h i ap a s t o r i su s i n g t h et e c h n i q u eo f o v e r l a p p i n g P C R ．T h es y n t h e s i z e d6 - p h y Aw a si n s e r t e d i n t o t h e v e c t o ro fp P I C 9 Kt o c o n s t

7、 r u c tt h e6 - p h y Ai n t e g r a t i v e e x p r e s s i n gv e c t o r ．T h i s v e c t o r w a st r a n s f o r m e d i n t o t h e h o s t P i c h i ap a s t o r i s o fG S 115 b ye l e c t r o p o r a t i o na n

8、 d t h eh i g hc o p y o f M u t + t r a n s f o r m a n t s o f 6 - p h y A w e r es e l e c t e d ．W eh a v e d e v e l o p e d as t r a i n o f P i c h i a P a s t o r i s h a v i n g a b i l i t y o f o v e r e x p r

9、 e s s i n gp e n i o p h o r al y c i i p h y t a s e ．B y t h i ss t u d y ，t h e f o l l o w i n g r e s u l t s w e r e a c h i e v e d ：1 ．A c c o r d i n gt o t h eG e n B a n k s e q u e n c eo f p e n i o p h o r

10、 al y c i ip h y t a s e ，f o u r t yf o u rp r i m e r sw e r eu s e dt o h a v es y n t h e s i z e d6 - P h y Ag e n es u c c e s s f u l l yu s i n g t h e o v e r l a pe x t e n s i o nP C R t e c h n o l o g y ．T h

11、 e r e s u l t o fa n a l y s i s f o r c o d o np r e f e r e n c e o f P i c h i ap a s t o r i si si d e a l ，a n dt h ec o d i n g —s e q u e n c e h o m o l o g y W a s 10 0 ％．2 ．T h r o u g ht h es e l e c t i o no

12、 fs i g n a lp e p t i d er e s e a r c h ，w ea t t e m p tt o f u s e6 - P h y Ai t s e l fs i g n a l p e p t i d e t o g e t h e r w i t h Ⅱ·s i g n a l p e p t i d e t o p r o m o t et h e e x p r e s s i o n o

13、fp h y t a s e ，h o w e v e rt h ee f f e c t i sn o ti d e a l ．B yr e s e a r c h i n gt h e6 - P h y A w i l dt y p es i g n a lp e p t i d e i ns a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e ．w ef o u n d e d t h a t6

14、 - P h y A c a n n o t b e e x p r e s s e d i nt h i s y e a s tc e l l su n d e rt h es t r o n gp r o m o t e ro fG D P d r i v e r ．T h i sp r o v e dt h a t t h ew i l dt y p es i g n a lp e p t i d ec a n n o t m a

15、 k e t h e p h y t a s e t os e c r e t i n g e x p r e s s i o n ．3 ．T h eP i c h i a p a i n s t o r i s e x p r e s s i o nv e c t o r ，p P I C 9 K ，w a ss u c c e s s f u l l y C On s t r u c t e d ．T h e nt h e h i

16、g h c o p yt r a n s f o r m a n t n a m e dG S I15 ／p P I C 9 K J L 6 p h w a s ’s c re e n e do u t a f t e r t h ep l a s m i dw a se l e t r o —t r a n s f o r m e d i n t o P i c h i ap a s t o r i s ，G S 115 ．4 揚(yáng)州大

17、學(xué)碩士學(xué)位論文目錄摘要?????????????????????1A b s t r a c t ．．．．．．．?．．．．．．．．．?．．．?．．．．．．．．?．．．．．．．?．．．．??：2目錄?????????????????????4符號說明???????????????????．．7第一章隔孢伏革菌( P e n i o p h o r a l y c ii ) 的植酸酶基因的合成與克隆??．81 材料與方法??????????

18、???????．81 ．1 引物的設(shè)計(jì)???????????????．81 ．2 6 一磷酸植酸酶( 6 - P h y A ) 基因的合成????????91 ．3 6 - P h y A 畢赤酵母密碼子嗜好分析?????????1 01 ．4 P C R 產(chǎn)物的克隆??????????????1 02 結(jié)果???????????????????1 12 ．1 L 6 p h 密碼子的畢赤酵母嗜好分析?????????1 12 ．2

19、p U C 5 7 ／6 一P h y A 轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒???????????1 33 本章小結(jié)?????????????????．．1 4第二章含野生型信號肽6 - P h y A 基因在畢赤酵母中的表達(dá)研究????1 51 材料與方法?????????????????1 51 ．1 畢赤酵母分泌型表達(dá)載體的構(gòu)建?????????1 51 ．2 畢赤酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化????????????．1 71 ．3 6 p h 在畢赤酵母中的表達(dá)?

20、??????????．2 01 ．4 植酸酶的生物學(xué)性質(zhì)的測定??????????．2 02 結(jié)果???????????????????2 22 ．1 畢赤酵母表達(dá)載體p P I C 9 K ／6 p h 的酶切鑒定??????2 22 ．2 畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的篩選???????．．????．2 32 ．3 6 p h 在畢赤酵母中表達(dá)???????．．??．??2 42 ．4 植酸酶活性的檢測?一．．??????????．．2 43 本