共表達(dá)PDI提高IFNβ-HSA在畢赤酵母中表達(dá)的研究.pdf

1、β干擾素(IFNβ)是干擾素家族中的一員，具有廣譜抗病毒、抗細(xì)胞增殖和免疫調(diào)節(jié)作用。為了改善IFNβ的體內(nèi)穩(wěn)定性，雷楗勇等構(gòu)建了β干擾素與人血清白蛋白融合蛋白(IFNβ-HSA)融合基因，將其在畢赤酵母系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，得到了長(zhǎng)效融合蛋白IFNβ-HSA。這種融合蛋白具有廣闊的生產(chǎn)及臨床應(yīng)用前景。但是該菌株表達(dá)量較低，為進(jìn)一步提高IFNβ-HSA的表達(dá)量，本文構(gòu)建雙重重組酵母，使其共表達(dá)具有分子伴侶活性的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)，并分

2、析產(chǎn)量差異。為進(jìn)一步提高IFNβ-HSA定量分析方法的靈敏度，本文對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)新方法進(jìn)行考核。
　　 參照GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)為EU805807的PDI基因序列設(shè)計(jì)引物，以畢赤酵母基因組為模板，采用PCR方法，擴(kuò)增PDI基因。將其插入到克隆載體pMD19-T中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19T-PDI，進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示克隆得到的PDI基因與GenBank公布的PDI基因序列完全一致。將該基因插入畢赤酵母表達(dá)載體p

3、PICZα-A中，構(gòu)建重組表達(dá)載體pPICZαA-PDI，經(jīng)Sac I線性化后電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母KM71/pPIC9K-IFNβ-HSA，得到雙重表達(dá)PDI和IFNβ-HSA的雙重重組子。搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明，共表達(dá)PDI的菌株較原始菌株目的蛋白IFNβ-HSA產(chǎn)量提高60％。
　　 IFNβ-HSA雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的優(yōu)化。將純化后的IFNβ-HSA融合蛋白作為抗原標(biāo)準(zhǔn)品，優(yōu)化緩沖體系、抗體工作濃度及實(shí)驗(yàn)條件，建立了新的檢

4、測(cè)方法。該方法的靈敏度達(dá)到13.88ng/mL，線性檢測(cè)范圍21.01ng/mL～672.50ng/mL，相關(guān)系數(shù)R2＞0.99。經(jīng)方法學(xué)考核，批內(nèi)、批間變異系數(shù)分別為2.46～8.89％和2.79～9.74％，發(fā)酵液上清回收率為91.30～108.44％，與IFNβ、HSA基本無(wú)交叉反應(yīng)，健全性分析表明發(fā)酵液及小鼠血清稀釋倍數(shù)對(duì)該方法無(wú)影響，穩(wěn)定性試驗(yàn)顯示預(yù)包被酶標(biāo)板可在4℃下穩(wěn)定保存3個(gè)月以上。
　　 本文研究結(jié)果表明共表達(dá)