牛乳鐵蛋白肽衍生肽的設計及其在畢赤酵母中表達與活性分析.pdf

1、牛乳鐵蛋白肽（LfcinB，lactoferricin Bovine）是一種含25個氨基酸殘基的抗菌短肽（FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF）由牛乳鐵蛋白（LfB，lactoferrin Bovine）在胃蛋白酶水解消化作用下由N-末端釋放，具有廣譜抗菌性，良好的耐熱性，免疫調(diào)節(jié)作用，無抗原性和對腸道益生菌無害性等特點。在不同來源的乳鐵蛋白肽中，牛乳鐵蛋白肽的生物活性最高，因此牛乳鐵蛋白肽及其衍生肽的研究應用受到越來越多

2、的關(guān)注，研究學者們期望能夠通過體外表達系統(tǒng)獲得高活性表達以及穩(wěn)定的LfcinB及其衍生肽，使其成為新型的抗生素替代物。
　　甲醇營養(yǎng)型酵母表達系統(tǒng)已廣泛應用于外源真核和原核蛋白的生產(chǎn)表達。作為一種成功的真核表達系統(tǒng)，其具有許多優(yōu)點：（1）強有力的啟動子（醇氧化酶基因，AOXⅠ）調(diào)控外源基因表達；（2）能高密度生長發(fā)酵，且營養(yǎng)要求低；（3）具有對表達蛋白進行翻譯后修飾和加工功能；（4）自身分泌蛋白少，目標蛋白的純化簡單。研究表明，畢

3、赤酵母表達系統(tǒng)已成功表達了200多種來源不同的外源蛋白產(chǎn)品。
　　本論文利用生物信息學工具、抗菌肽數(shù)據(jù)庫以及蛋白質(zhì)分析軟件，對抗菌肽結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系進行了分析，然后對對牛乳鐵蛋白肽衍生肽（LfcinBD）進行優(yōu)化設計。將設計的牛乳鐵蛋白肽衍生肽基因與畢赤酵母表達載體pPIC9K構(gòu)建重組表達載體pPIC9K-LfcinBD。將重組質(zhì)粒線性化后電轉(zhuǎn)化感受態(tài)畢赤酵母細胞GS115，利用遺傳霉素G418，篩選高拷貝的抗性轉(zhuǎn)化子。實驗對發(fā)酵

4、上清液進行了分離純化和活性測試，SDS-PAGE電泳檢測到了目標蛋白的有效表達。實驗還對優(yōu)化設計得到的牛乳鐵蛋白肽衍生肽與同等發(fā)酵條件下產(chǎn)生的天然牛乳鐵蛋白肽的抑菌活性進行了對比分析，結(jié)果證明設計得到的衍生肽對金黃色葡萄球菌有更強的抑菌活性。研究表明經(jīng)色氨酸Trp替換的牛乳鐵蛋白肽衍生肽，其疏水性提高，增加了與細菌膜脂質(zhì)雙分子層作用，促進了LfcinBD的抑菌活性，證明了LfcinBD設計的合理性。為進一步探究LfcinBD的生物活性奠