抗菌肽OncorhyncinⅡ的克隆及其在畢赤酵母中的表達(dá)、純化及抗菌機(jī)制研究.pdf

1、抗菌肽（Antimicrobial peptide，AMPs）是一類廣泛存在于生物體內(nèi)、在生物遭受外界異物或病原微生物刺激時(shí)能快速產(chǎn)生的小分子多肽。研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽具有多種生物學(xué)活性，它不僅對(duì)病原微生物如細(xì)菌、真菌、病毒和原蟲(chóng)等具有廣譜的殺滅作用，還能抑殺癌變細(xì)胞、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等?？咕囊云鋸V譜、安全且無(wú)耐藥等生物學(xué)特點(diǎn)，有可能被開(kāi)發(fā)成為一種新型的抗生素來(lái)替代傳統(tǒng)抗生素在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和食品等領(lǐng)域應(yīng)用。本課題的研究對(duì)象抗菌肽Oncorhyn

2、cinⅡ分離自虹鱒魚(yú)(Oncorhynchus mykiss)的表皮分泌物中，它是由69個(gè)氨基酸殘基組成，分子量約為7.2kDa，等電點(diǎn)為12.96，具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，在微摩爾濃度下便能抑制革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的生長(zhǎng)，而且在發(fā)揮抗菌活性的同時(shí)并未出現(xiàn)溶血作用。本課題研究借助基因工程技術(shù)構(gòu)建生產(chǎn)來(lái)源于虹鱒魚(yú)表皮分泌物中的抗菌肽OncorhyncinⅡ的畢赤酵母生產(chǎn)菌株，并將其發(fā)酵后進(jìn)行分離純化以獲得高純度的目的多肽，最后初步探究抗菌

3、肽OncorhyncinⅡ的抗菌機(jī)制。
　　 1畢赤酵母（Pichia pastoris）表達(dá)載體及工程菌株的構(gòu)建
　　 采用RT-PCR的方法從虹鱒魚(yú)的表皮中獲得抗菌肽OncorhyncinⅡ的cDNA序列，并將其克隆至載體pGEM(R)-TEasy上，然后測(cè)序驗(yàn)證序列的正確性。根據(jù)抗菌肽OncorhyncinⅡ的基因序列設(shè)計(jì)上下游引物，以O(shè)ncorhyncinⅡ/pGEM(R)-TEasy為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以獲

4、得目的片段。將獲得的目的片段和載體分別用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和KpnⅠ進(jìn)行雙酶切，然后用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，最后成功構(gòu)建出畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒pGAOnⅡ。將重組表達(dá)質(zhì)粒pGAOnⅡ和質(zhì)粒pGAPZαA經(jīng)BlnⅠ線性化處理后電擊轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GS115中，在含有Zeocin TM的YPDS培養(yǎng)基上篩選獲得抗性轉(zhuǎn)化子。在含有1000μg/mL ZeocinTM的YPDS培養(yǎng)基上得到高拷貝轉(zhuǎn)化子，經(jīng)過(guò)PCR驗(yàn)證，獲得了高拷貝的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子

5、。將高拷貝的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)后用Tricine-SDS-PAGE檢測(cè)目的多肽的表達(dá)，目的條帶與預(yù)期的分子量一致，結(jié)果表明重組表達(dá)的抗菌肽OncorhyncinⅡ成功被分泌至胞外。發(fā)酵液上清中的抑菌活性分析表明，重組抗菌肽OncorhyncinⅡ具有一定的抗菌活性，它對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制作用明顯強(qiáng)于對(duì)革蘭氏陰性菌及真菌的抑菌作用。對(duì)發(fā)酵液上清中抗菌肽OncorhyncinⅡ的穩(wěn)定性研究表明，抗菌肽OncorhyncinⅡ具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，

6、且能耐受反復(fù)凍融的處理。
　　 2抗菌肽OncorhyncinⅡ的分離純化及性質(zhì)研究
　　 首先采用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂SP Sepharose Fast Flow對(duì)發(fā)酵液中的抗菌肽進(jìn)行分離純化，用Tricine-SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2號(hào)洗脫峰存在目的多肽OncorhyncinⅡ，且雜蛋白的分子量在1.5kDa以上。第二步選擇10kDa的超濾膜分離系統(tǒng)，將分子量較大的雜蛋白截留，而小于10kDa的目的多肽和大部分鹽分

7、被濾出。將截留液和濾出液進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果與預(yù)期相同，目的多肽被保留于濾出液中。最后用1kDa的透析袋透析脫鹽，凍干后得到抗菌肽OncorhyncinⅡ純品。高純度的抗菌肽OncorhyncinⅡ仍然具有明顯的抑菌作用，對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為0.54μg/L。
　　 3抗菌肽OncorhyncinⅡ的抗菌機(jī)制研究
　　 選用金黃色葡萄球菌最為受試菌株，首先研究抗菌肽Oncorhync

8、inⅡ的抑菌動(dòng)力學(xué)。觀察抗菌肽OncorhyncinⅡ?qū)瘘S色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OncorhyncinⅡ?qū)瘘S色葡萄球菌的抑制作用迅速、高效，且與作用時(shí)間呈正相關(guān)。觀察抗菌肽OncorhyncinⅡ?qū)瘘S色葡萄球菌細(xì)胞通透性的影響，結(jié)果表明抗菌肽可導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞的通透性增強(qiáng)，可能以菌體內(nèi)容物泄露的方式導(dǎo)致細(xì)菌的死亡。其次采用活細(xì)胞工作站和透射電鏡技術(shù)觀察抗菌肽OncorhyncinⅡ作用于金黃色葡萄球菌的形態(tài)變化。
　

9、　 本研究取得的主要研究成果有：
　　 1.成功構(gòu)建了抗菌肽OncorhyncinⅡ畢赤酵母分泌表達(dá)質(zhì)粒pGAOnⅡ，并采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)OncorhyncinⅡ進(jìn)行分泌表達(dá)，獲得了具有抗菌活性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的重組表達(dá)產(chǎn)物。
　　 2.成功建立重組抗菌肽OncorhyncinⅡ的分離純化工藝，最終獲得了純度較高、活性和穩(wěn)定性較好的抗菌肽OncorhyncinⅡ。
　　 3.初步探究了抗菌肽Oncorhynci