金環(huán)蛇抗菌肽Cath-BF在畢赤酵母中的組成型分泌表達(dá).pdf

1、痤瘡是一種常見(jiàn)的毛囊皮脂腺炎癥性皮膚病，主要由厭氧性座瘡丙酸桿菌所致，目前主要采用抗生素治療，但療效不理想，并且可導(dǎo)致抗性菌的產(chǎn)生和超敏反應(yīng)。新近從金環(huán)蛇蛇毒中分離的抗菌肽Cath-BF屬于第一個(gè)被報(bào)道的脊椎動(dòng)物來(lái)源抗菌肽，該抗菌肽可在小鼠模型中有效抑制痤瘡丙酸桿菌及其它痤瘡感染菌的生長(zhǎng)，并抑制相關(guān)炎性增生，因此在痤瘡防治中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。天然分離的Cath-BF為30個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，而根據(jù)其 cDNA編碼產(chǎn)物推斷的該抗菌肽

2、在 N端應(yīng)該還有4個(gè)氨基酸殘基，即天然長(zhǎng)度應(yīng)該為34個(gè)氨基酸殘基，但目前尚未有實(shí)驗(yàn)證明該結(jié)構(gòu)形式的抗菌肽是否存在及有無(wú)抑菌活性。蛇毒來(lái)源有限，從中制備抗菌肽得率低，成本高，化學(xué)合成抗菌肽同樣存在成本高的問(wèn)題，因此，采用基因工程手段建立高效生產(chǎn)方法對(duì)于Cath-BF的推廣應(yīng)用具有現(xiàn)實(shí)意義。畢赤酵母（Pichia pastoris）系統(tǒng)是最成熟的外源基因高效表達(dá)系統(tǒng)，遺傳背景清楚、可高密度發(fā)酵，因而具有良好的工業(yè)化性能。其組成型表達(dá)系統(tǒng)是基

3、于磷酸甘油醛脫氫酶的強(qiáng)啟動(dòng)子 pGAP，無(wú)需像AOX1啟動(dòng)子那樣采用甲醇誘導(dǎo)，用于人用產(chǎn)品的生產(chǎn)更安全。另外，Cath-BF作為小分子多肽，很難獨(dú)立表達(dá)，分泌表達(dá)可以避免小肽被胞內(nèi)蛋白酶降解，并且產(chǎn)物容易純化。本研究采用畢赤酵母組成型分泌表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建兩種長(zhǎng)度Cath-BF的高效表達(dá)工程菌，體外研究二種長(zhǎng)度重組抗菌肽抑菌活性，并建立高效發(fā)酵工藝和分離純化方法，為Cath-BF的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.

4、Cath-BF30與Cath-BF34目的基因合成
　　采用畢赤酵母偏好密碼子設(shè)計(jì)30肽與34肽Cath-BF的編碼序列，首尾分別加上酶切位點(diǎn)、終止密碼子等，采用引物重疊延伸PCR法（Overlap extensionPCR）合成目的基因。
　　2.Cath-BF30與Cath-BF34表達(dá)載體的構(gòu)建
　　以畢赤酵母系統(tǒng) pGAPZα載體為基礎(chǔ)，目的片段與分泌信號(hào)肽 MF-α融合后克隆于啟動(dòng)子GAP的下游，以便在葡萄糖

5、做基礎(chǔ)碳源的條件下組成型分泌表達(dá)N端為天然序列的抗菌肽。
　　3.Cath-BF30與Cath-BF34畢赤酵母工程菌高效表達(dá)株的構(gòu)建
　　將目的基因表達(dá)載體質(zhì)粒線(xiàn)性化后電轉(zhuǎn)化蛋白酶缺陷型宿主畢赤酵母SMD1168細(xì)胞，篩選博來(lái)霉素高抗性轉(zhuǎn)化子，取高抗性轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)上清進(jìn)行丙酸桿菌抑菌斑篩選，選取上清抑菌活性強(qiáng)的轉(zhuǎn)化子作為抗菌肽工程菌。
　　4.Cath-BF30與Cath-BF34表達(dá)產(chǎn)物活性分析
　　工程菌在搖

6、瓶水平上培養(yǎng)，收集培養(yǎng)上清，96孔板法觀察上清對(duì)痤瘡丙酸桿菌厭氧培養(yǎng)物的生長(zhǎng)抑制作用。
　　5.培養(yǎng)基pH和發(fā)酵時(shí)間對(duì)Cath-BF30與Cath-BF34分泌水平的影響
　　分別設(shè)立pH4.0，pH5.0，pH6.0和pH7.0等四種培養(yǎng)基，觀察不同pH培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時(shí)間下所獲培養(yǎng)上清的抑菌活性。
　　6.Cath-BF34畢赤酵母工程菌的發(fā)酵
　　工程菌在最適pH和溫度條件下于5L發(fā)酵罐中發(fā)酵，發(fā)酵周期為72

7、h，收集發(fā)酵上清。
　　7.Cath-BF34畢赤酵母工程菌發(fā)酵產(chǎn)物的純化
　　根據(jù)Cath-BF等電點(diǎn)為強(qiáng)堿性（pI=11.2）這一特性，采用強(qiáng)陽(yáng)離子SP Sepharose FF柱將表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。
　　結(jié)果：
　　1.成功克隆Cath-BF30與Cath-BF34編碼序列，該序列基于畢赤酵母偏愛(ài)密碼子設(shè)計(jì)，N端與分泌信號(hào)肽MFα下游無(wú)縫融合，可保證分泌產(chǎn)物為天然N端序列。
　　2.獲得了Cath

8、-BF30與Cath-BF34的畢赤酵母高效分泌表達(dá)菌株，二者的分泌表達(dá)產(chǎn)物都具有抑制痤瘡桿菌的活性。
　　3.Cath-BF工程菌在培養(yǎng)基pH4.0條件下分泌水平最高，產(chǎn)物最穩(wěn)定，當(dāng)pH為5以上時(shí)培養(yǎng)上清抗菌活性低，且在培養(yǎng)后期幾乎檢測(cè)不到抗菌活性，表明需要在較低 pH條件下培養(yǎng)才能有效抵抗宿主細(xì)胞蛋白酶的降解作用。
　　4. Cath-BF工程菌在以葡萄糖做碳源的完全培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)，并采取碳源控制手段時(shí)，可實(shí)現(xiàn)較高密度