酵母和人Elp3在畢赤酵母中的分泌表達(dá)及活性測定.pdf

1、目的：Elongator復(fù)合物作為高度磷酸化的RNA聚合酶II的一部分于1999年從酵母染色質(zhì)的延伸復(fù)合物中被首次分離出來，較多的證據(jù)表明該復(fù)合物在染色質(zhì)模板的轉(zhuǎn)錄延伸中具有功能。它有六個(gè)亞基組成，引人矚目的是其第三個(gè)亞基Elp3擁有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，屬于GNAT家族。缺失Elp3(或其它亞基)可導(dǎo)致多種生長缺陷，其中有些與轉(zhuǎn)錄延伸缺陷相關(guān)。最近有報(bào)道稱Elp3蛋白在神經(jīng)生物學(xué)中有著至關(guān)重要的作用。Elongator復(fù)合物可對組蛋白

2、H3的14位賴氨酸和組蛋白H4第8位賴氨酸進(jìn)行乙?；揎棧移銫末端的保守的HAT活性中心為Elongator行使功能所必需。生物信息學(xué)分析表明Elp3的N末端有一個(gè)類似S-腺苷甲硫氨酸激酶的結(jié)構(gòu)域，這個(gè)結(jié)構(gòu)域包含F(xiàn)e4S4簇，可結(jié)合S-腺苷甲硫氨酸，因而認(rèn)為Elp3除了HKT活性外，可能還具有一個(gè)未知功能的催化結(jié)構(gòu)域。第一種組蛋白去甲基化酶--LSD1及其在調(diào)節(jié)基因開啟和關(guān)閉過程中重要作用的發(fā)現(xiàn)提示：Elongator復(fù)合物不僅僅是一

3、種組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶，它可能也是一種組蛋白去甲基化酶。但Greenwood等人(2009)研究表明Elongator無組蛋白去甲基化酶活性，Elp3的FeS簇為Elongator保持結(jié)構(gòu)完整性所必需。因此Elp3是否具有組蛋白去甲基化酶活性尚不確定。 鑒于此，本論文構(gòu)建了酵母和人Elp3基因全長的分泌型表達(dá)載體，并在GS115受體菌中利用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，純化后的蛋白在體外進(jìn)行組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性和組蛋白去甲基化酶活性測定。

4、 方法：為確定Elp3是否具有組蛋白去甲基化酶活性，分別以質(zhì)粒pYES2-yelp3和pYES2-help3為模板，PCR擴(kuò)增酵母和人Elp3基因全長，克隆入畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9KH中，線性化后轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115菌株，利用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。Ni-NTA親和層析純化、蛋白質(zhì)免疫印跡驗(yàn)證。測定其組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性后，將純化的蛋白與提取的組蛋白八聚體底物進(jìn)行組蛋白去甲基化的反應(yīng)，從而證明其是否具有組蛋白去甲基化酶活性。