畢赤酵母表達gp96-scFv抗體及生物活性測定.pdf

1、熱休克蛋白gp96（又稱作GRP94）是hsp90家族的一員，與細胞質中的hsp90具有50％的同源性。它主要存在于內質網中，也有一部分位于癌細胞的膜表面。與其它熱休克蛋白一樣，gp96的主要生物學功能是分子伴侶的功能，它參與蛋白的折疊、轉運、降解及多聚體的組裝等。gp96可以特異性結合抗原肽，增強抗原呈遞的特性使其作為一種新型免疫佐劑被廣泛應用于細菌及流感、人乳頭瘤病毒、艾滋病、乙型肝炎等病原感染的研究中。越來越多的研究發(fā)現gp96在

2、腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，腫瘤細胞的快速生長會導致腫瘤缺氧、缺血及局部酸中毒，這些應激條件刺激腫瘤組織表達產生包括gp96在內的許多熱休克蛋白，熱休克蛋白可能作為分子伴侶來調節(jié)腫瘤的不斷增殖從而使腫瘤細胞克服各種不利的生理環(huán)境。并且gp96的表達與腫瘤的發(fā)生，發(fā)展及細胞分化呈現相關性。同樣gp96在一些致病菌包括病毒的入侵，胞內擴增等過程中發(fā)揮重要作用。因此，獲得特異性結合gp96的抗體檢測gp96的表達，同時采用抗體靶向中和gp96來抑制與其

3、有關疾病如腫瘤的發(fā)生，都有很重要的意義。
　　目的:本文利用畢赤酵母分泌表達gp96-scFv抗體，純化后得到能特異性結合gp96抗原的小分子抗體片段(scFv)。方法:根據文獻報道的gp96-scFv抗體基因序列，合成gp96-scFv抗體基因序列，將gp96-scFv抗體序列克隆到畢赤酵母表達質粒pPICZα-A，線性化的重組表達載體電轉化到畢赤酵母X33，甲醇誘導目的蛋白表達，通過親和層析法純化目的蛋白，并以SDS-PAGE

4、和Western blot進行鑒定。通過Western blot、Immunofluorescence、ELISA、FACS方法對gp96-scFv抗體的生物活性進行了檢測。結果:成功地構建了分泌表達抗gp96蛋白scFv抗體的畢赤酵母菌，每升畢赤酵母菌培養(yǎng)上清經純化可獲約50mg gp96-scFv抗體，所獲抗體其分子量大約為15kDa。具有與gp96抗原特異性結合的活性。結論:本研究利用畢赤酵母菌成功表達了重組gp96-scFv抗體