重癥肌無力單鏈抗體A7在畢赤酵母中的表達(dá)及檢測.pdf

1、目的：將抗乙酰膽堿受體單鏈抗體(single chain variable fragment，ScFv)基因轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115，篩選陽性轉(zhuǎn)化子并誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，制備單鏈抗體蛋白。方法：從Ecoli．DH5α，中提取目的基因并純化，將電泳檢查后確認(rèn)正確的pPIC9K重組載體經(jīng)過限制性核酸內(nèi)切酶SalⅠ線性化處理，電穿孔導(dǎo)入甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母GS115中，提取酵母基因組DNA進(jìn)行PCR，檢測外源基因的插入情況。挑取拷貝數(shù)高的陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)

2、行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，應(yīng)用鼠抗c-myc單克隆抗體進(jìn)行斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)檢查酵母培養(yǎng)上清液中單鏈抗體A7蛋白的表達(dá)情況。并用十二烷基硫酸鈉．聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白印跡試驗(yàn)(WestemBlotting)確認(rèn)目的蛋白的分子量。結(jié)果：電泳檢查發(fā)現(xiàn)了大小分別為10000 bp和9300 bp左右的重組載體pPIC9K-ScFvA7基因和真核表達(dá)載體pPIC9K基因片段；經(jīng)PCR后電泳確定目的基因已整合到畢赤酵母染色體基因組中。經(jīng)檢測