重癥肌無(wú)力抗乙酰膽堿受體單鏈抗體A7基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、重癥肌無(wú)力(myastheniagravis，MG)是抗乙酰膽堿受體(acetylcholinereceptor,AchR)抗體介導(dǎo)的器官特異性自身免疫病。AchR是由α2βγδ五個(gè)同源亞單位組成的跨膜糖蛋白，MG患者血清中多數(shù)抗AchR抗體針對(duì)的是α亞單位上的主要免疫原區(qū)(mainimmunogenicregion，MIR)。當(dāng)致病性抗體與神經(jīng)肌肉接頭處突觸后膜上相鄰兩個(gè)AchRα亞單位上的MIR相結(jié)合后，通過(guò)抗原調(diào)變或激活補(bǔ)體作用使

2、突觸后膜損傷，AchR數(shù)量減少，結(jié)果出現(xiàn)肌肉收縮無(wú)力。由抗AchR抗體制備的單鏈抗體(singlechainvariablefragment，ScFv)作為單價(jià)片段，只能與一個(gè)α亞單位上的MIR結(jié)合，因此不引起抗原調(diào)變作用，且ScFv無(wú)Fc段，不能激活補(bǔ)體導(dǎo)致AchR損傷；但是，ScFv與MIR結(jié)合后，可以特異性地封閉抗AchR抗體的結(jié)合位點(diǎn)，從而對(duì)AchR起到保護(hù)作用。 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法從重組質(zhì)粒pHEN2

3、-ScFvA7上擴(kuò)增出鼠源性ScFvA7基因，應(yīng)用純化試劑盒進(jìn)行純化。純化后的PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ和AvrⅡ雙酶切后用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳回收并純化，再與經(jīng)同樣酶切并純化的真核表達(dá)載體pPIC9K連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α并擴(kuò)增，再用AvrⅡ和EcoRⅠ酶切檢查ScFvA7基因插入的正確性。構(gòu)建pPIC9K-ScFvA7重組載體經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)核苷酸序列正確，并且ScFvA7基因正確克隆至載體開(kāi)放讀碼框架內(nèi)。結(jié)果表明已成功的構(gòu)