抗人乙酰膽堿受體單鏈抗體1956#的可溶性表達、純化及其功能鑒定.pdf

1、重癥肌無力（MG）是由乙酰膽堿受體抗體(AChRAbs)介導，補體參與的自身免疫性疾病，由于其抗原、抗體明確且免疫學發(fā)病機制也相對清楚，對研究其他自身免疫性疾病的發(fā)病機制和治療具有指導意義?？谷薃ChR的單鏈抗體（scFv）是單價抗體并且缺乏Fc段，不會引起抗原調(diào)變作用或激活補體破壞突觸后膜，可以保護NMJ突觸后膜的AChR免受MG患者血清中自身抗體的攻擊，成為MG治療最有潛力的靶點。
　　以往scFv的可溶性表達多采用載體pHE

2、N1，以帶信號肽PelB的分泌型表達形式進行。盡管可以直接在胞周質(zhì)或培養(yǎng)上清中得到可溶性scFv，然而這種方式存在可溶性蛋白產(chǎn)量低，純化過程代價高的缺陷，給大量制備帶來困難。本研究擬采用融合NusA標簽蛋白的方式表達scFv1956＃，以期得到大量可溶性的表達產(chǎn)物。
　　用PCR擴增含有抗人AChRscFv1956＃的載體pHEN1中scFv1956＃的結構基因，并將其插入到原核表達載體pET44a(+)中。用重新構建的載體pET

3、44a(+)-scFv1956＃轉(zhuǎn)化菌株BL21(DE3)pLysS和Roseta-garmiB(DE3)；同時用原有載體pHEN1-scFv1956＃轉(zhuǎn)化菌株HB2151和JM109，分別用兩種誘導條件誘導表達：標準的1mMIPTG，37℃誘導4h；低溫25℃長時間誘導20h。用SDS-PAGE來比較不同載體和菌株在不同溫度和時間的誘導條件下scFv1956＃可溶性表達的量，并通過Westernblot進行鑒定。
　　結果顯示P

4、CR產(chǎn)物大小為785bp，與預計相符；所構建質(zhì)粒經(jīng)測序證實scFv1956＃核苷酸序列正確，并正確插入載體pET44a(+)。SDS-PAGE和Westernblot的結果顯示，新構建的載體pET44a(+)-scFv1956＃在不同菌株和誘導條件下所得到的可溶性蛋白表達量均優(yōu)于原載體pHEN1-scFv1956＃。對于載體pHEN1-scFv1956＃，換不同菌株表達或采用低溫長時間的誘導方式均不能提高胞周質(zhì)或培養(yǎng)上清中可溶性蛋白的含

5、量；而對于載體pET44a(+)-scFv1956＃，低溫長時間誘導確實有助于提高可溶性表達的量，而且用菌株BL21(DE3)pLysS表達時這種趨勢更為明顯。
　　用菌株BL21(DE3)pLysS表達pET44a(+)-scFv1956＃，1mMIPTG，25℃誘導20h，裂菌后的可溶性成分經(jīng)Ni2+親和層析柱純化，并用凝血酶（Thrombin）切除融合蛋白上的NusA標簽。Westernblot的結果證實酶切后相對分子量為2