蓖麻毒素B鏈可溶性表達(dá)及其工藝優(yōu)化、純化.pdf

1、目的:通過大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，實(shí)現(xiàn)重組蓖麻毒素B鏈蛋白的大量可溶性表達(dá)，并提高其純度。目的是用重組蛋白作為抗原，為制備抗體以及蓖麻毒素疫苗的研究提供前期技術(shù)支持和理論基礎(chǔ)。
　　方法:本實(shí)驗(yàn)首先通過PCR擴(kuò)增出目的基因RTB連接于pMD-18T克隆載體，經(jīng)序列比對(duì)正確后，將目的基因插入到表達(dá)載體P300-TrxA-Sumo和pGEX-4T-1中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒P300-TrxA-Sumo-RTB及pGEX-4

2、T-1-RTB。將鑒定構(gòu)建成功的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，建立表達(dá)工程菌 P300-TrxA-Sumo-RTB/BL21、pGEX-4T-1-RTB/BL21。通過IPTG的誘導(dǎo)，利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)法在不同誘導(dǎo)時(shí)間、不同IPTG濃度以及不同溫度的情況下對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)對(duì)RTB的可溶性表達(dá)。通過Ni-Chelating Sepharose親和層析柱純化得到純度相對(duì)較高的重組蛋白，最后切去Sumo標(biāo)簽，

3、得到目的蛋白R(shí)TB。并通過Western blot和間接ELISA法證明其具有良好的免疫原性。檢測(cè)RTB作用于RAW264.7細(xì)胞的一氧化氮水平。最后用MTT法檢測(cè)RTB作用于小鼠巨噬細(xì)胞時(shí)存活情況。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒P300-Trxa-Sumo-RTB以及pGEX-4T-1-RTB。在經(jīng)過誘導(dǎo)條件的優(yōu)化后，成功實(shí)現(xiàn)重組蓖麻毒素蛋白的大量可溶性表達(dá)，表達(dá)量分別為11％和8％。通過親和層析柱純化得到純度相對(duì)較高的目的蛋

4、白。經(jīng)過Western blot和ELISA驗(yàn)證目的蛋白具有免疫原性。一氧化氮檢測(cè)結(jié)果顯示，RTB組數(shù)值較正常細(xì)胞組增高，說明RTB能夠促進(jìn)NO的釋放，可能作為治療巨噬細(xì)胞相關(guān)炎癥性疾病的突破口。通過MTT法證明純化得到的RTB對(duì)于小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7不具有毒性。
　　結(jié)論:經(jīng)大腸桿菌誘導(dǎo)條件工藝優(yōu)化后，可實(shí)現(xiàn)重組蓖麻毒素B鏈蛋白可溶性表達(dá)。經(jīng)Ni-NTA、GST標(biāo)簽親和層析柱純化后獲得具有生物學(xué)活性的蛋白，且重組蛋白具有