可溶性TRAIL的表達、純化及其對三種大腸癌細胞作用的初步分析.pdf

1、目的：
　　1.表達并純化較高活性的TRAIL蛋白，優(yōu)化表達條件。
　　2.觀察TRAIL對大腸癌細胞HCT116、SW480和SW620細胞增殖的影響，并對機制進行初步分析。
　　方法：
　　1. TRAIL的表達與純化。
　　擴大培養(yǎng)含pET-d-TRAIL質(zhì)粒的大腸桿菌DH5?，IPTG誘導表達TRAIL蛋白。表達產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA親和層析和離子交換層析純化。利用MTT法測定純化產(chǎn)物對大腸癌細胞SW4

2、80增殖的影響。分別改變誘導劑 IPTG的濃度和誘導時間，從而確定誘導TRAIL的最適條件。在親和層析過程中采用兩種洗脫TRAIL的方式，并改變透析的時間，對比以上條件對TRAIL活性的影響。
　　2.初步分析TRAIL對HCT116、SW480和SW620的增殖的影響。
　　在HCT116、SW480和SW620三種大腸癌細胞中分別加入0、100、200和400?g/ml的TRAIL，培養(yǎng)12 h后，光鏡下觀察TRAIL對

3、細胞形態(tài)的影響；MTT法測定TRAIL對細胞增殖的影響；用 western blot檢測三種細胞中 DR5、caspase-3、caspase-6、caspase-7、caspase-8和XIAP的蛋白表達水平；轉(zhuǎn)染caspase-8質(zhì)粒至SW620細胞，進一步觀察高表達caspase-8的SW620細胞對TRAIL敏感性。
　　結(jié)果：
　　1.確定最適誘導條件：TRAIL工程菌在培養(yǎng)4 h后進入對數(shù)生長期，在IPTG濃度為

4、0.5 mmol/L條件下37℃誘導6 h，TRAIL的蛋白表達量占總蛋白的比例達到20％。
　　2.純化出純度高于95%的可溶性TRAIL蛋白。
　　3.在細胞生長處于對數(shù)生長期時分別加入0、100、200和400?g/ml的TRAIL并培養(yǎng)12 h。MTT實驗顯示HCT116的細胞活力分別為對照組的65%、28%、6%。SW480細胞的活力分別為對照組的85%、65%、42%。SW620的細胞活力分別為對照組的95%、9

5、4%、91%。
　　4. Western blot顯示HCT116、SW480、SW620中caspase-3、caspase-6、caspase-7和caspase-8的蛋白表達量逐漸降低，DR5的蛋白表達量則逐漸升高，XIAP的表達水平從高到低則依次為SW480、SW620和HCT116。
　　5. SW620細胞轉(zhuǎn)染caspase-8后，在100?g/ml TRAIL作用下，細胞活力降低了33%。
　　結(jié)論：