XAF1在胃腸道腫瘤中的表達(dá)及其在大腸癌細(xì)胞中作用的初步研究.pdf

1、研究背景： 大腸癌是我國(guó)高發(fā)病率的惡性腫瘤之一，近年來(lái)發(fā)病率有升高趨勢(shì)，死亡率居高不下。腫瘤的發(fā)生多伴隨或后繼于癌基因/抑癌基因的突變和表達(dá)調(diào)控的異常，突變包括基因缺失、移碼突變和點(diǎn)突變等，表達(dá)調(diào)控的異常在基因的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后的剪切及翻譯水平都可發(fā)生。 XAF1是由Liston等首先從酵母雙雜交系統(tǒng)中鑒定到的XIAP相關(guān)因子，能與XIAP直接結(jié)合拮抗其抑制caspase活性而起促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。近來(lái)的研究顯示XAF1尚有

2、XIAP非依賴(lài)性的促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，并在腫瘤細(xì)胞中低表達(dá)或不表達(dá)，因此被認(rèn)為是腫瘤抑制基因。目前發(fā)現(xiàn)XAF1的mRNA有5種轉(zhuǎn)錄(剪切)變異體XAF1A、XAF1B、XAF1CXAF1D和XAF1E：分別編碼不同的蛋白，XAF1A的研究較多，有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。有文獻(xiàn)報(bào)道XAF1B、XAF1C可能拮抗XAF1A的作用，而Chung等人報(bào)道XAF1B、XAF1C、XAF1D、XAF1E和XAF1A一樣均起促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。

3、 腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤細(xì)胞的分化、增殖與凋亡密切相關(guān)，因此探討腫瘤細(xì)胞分化、增殖或凋亡相關(guān)基因?qū)沂灸[瘤發(fā)生機(jī)制，探索腫瘤本質(zhì)及其在腫瘤治療中具有十分重要的科學(xué)意義。全反式維甲酸及干擾素是細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑，同時(shí)全反式維甲酸及干擾素又能誘導(dǎo)XAF1A的表達(dá)，XAF1是否參與腫瘤細(xì)胞的分化目前尚無(wú)報(bào)道。 研究目的： 鑒于XAF1多個(gè)轉(zhuǎn)錄變異體在腫瘤中的作用及其在腫瘤細(xì)胞分化中的作用尚不明確，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)XAF1三個(gè)轉(zhuǎn)錄變異

4、體XAF1A、XAF1B、XAF1C及XAF1A蛋白在胃腸道腫瘤細(xì)胞系中及大腸癌及癌前病變中的表達(dá)，并通過(guò)上調(diào)XAF1A在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)觀察XAF1A對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖分化的影響，初步探討XAF1基因在腫瘤中的可能作用，為闡明大腸癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制及腫瘤治療提供研究資料。 材料與方法： 1.材料：胃腸道腫瘤細(xì)胞株及正常轉(zhuǎn)化細(xì)胞：由本實(shí)驗(yàn)保存；臨床石蠟組織標(biāo)本(包括正常、腺瘤、癌組織)：本科室的病理室提供；新鮮胃腸道正常、息肉、

5、腫瘤及相應(yīng)的癌旁組織：南方醫(yī)院消化內(nèi)鏡中心及手術(shù)室收集；pcDNA3.1/XAF1相關(guān)質(zhì)粒及熒光素酶報(bào)告基因相關(guān)質(zhì)粒：王繼德教授提供。 2.XAF1三個(gè)轉(zhuǎn)錄變異體在胃腸道腫瘤細(xì)胞系、大腸癌、癌前病變及經(jīng)過(guò)干擾素誘導(dǎo)后的MGC803細(xì)胞中的表達(dá)情況檢測(cè)：RT-PCR； 3.XAF1在胃腸道腫瘤細(xì)胞株及大腸腫瘤組織中的表達(dá)情況檢測(cè)：Westernblotting； 4.XAF1在大腸腫瘤組織、息肉組織及正常組織中的表

6、達(dá)情況檢測(cè)：免疫組織化學(xué)染色法； 5.脂質(zhì)體XAF1A穩(wěn)定和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞系的構(gòu)建； 6.上調(diào)XAF1A對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響檢測(cè)：MTT方法； 7.評(píng)估過(guò)表達(dá)XAF1A對(duì)survivin啟動(dòng)子和catenin啟動(dòng)子活性的影響：熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)技術(shù)； 8.過(guò)表達(dá)XAF1A對(duì)胃腸道腺癌分化指標(biāo)E-cadherin、Villin、Pan-CEA蛋白的影響檢測(cè)：Westernblotting：

7、 9.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS11.5軟件包處理數(shù)據(jù)，RT-PCR結(jié)果采用x2檢驗(yàn)，Westernblotting結(jié)果采用單樣本t檢驗(yàn)，免疫組化結(jié)果采用x2檢驗(yàn)，MTT結(jié)果采用兩樣本t檢驗(yàn)，以P≤0.05表示差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果采用兩樣本t檢驗(yàn)，以P≤0.10表示差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1.RT-PCR結(jié)果顯示在胃腸道腫瘤細(xì)胞株和正常轉(zhuǎn)化細(xì)胞中，XAF1三個(gè)轉(zhuǎn)錄變異體多不表達(dá)或低表達(dá)，在2株半懸浮細(xì)

8、胞株中，XAF1三個(gè)轉(zhuǎn)錄變異體均高表達(dá)。Westernblotting結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞中XAF1A蛋白水平與其mRNA表達(dá)水平相一致，經(jīng)過(guò)干擾素誘導(dǎo)后，XAF1三個(gè)轉(zhuǎn)錄變異體的表達(dá)均升高； 2.RT-PCR結(jié)果顯示在大腸癌及癌旁組織中，XAF13個(gè)轉(zhuǎn)錄變異的陽(yáng)性表達(dá)率的差異均無(wú)顯著性意義，大腸腺瘤及大腸癌組織中XAF1B、XAF1C的陽(yáng)性率顯著低于正常人腸組織(P<0.05)； 3.免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，與正常黏膜和增

9、生性息肉組織相比，XAF1在腺瘤及癌組織的胞核表達(dá)強(qiáng)度降低(P<0.05)，胞漿表達(dá)強(qiáng)度強(qiáng)度增高(P<0.05)，總體表達(dá)強(qiáng)度降低(P<0.05)； 4.MTT結(jié)果顯示在不同的血清濃度下(4％、10％)XAF1A都有抑制細(xì)胞增殖的作用(P<0.05)；瞬時(shí)轉(zhuǎn)染時(shí)，XAF1對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用隨著轉(zhuǎn)染質(zhì)粒劑量的增加而增強(qiáng)，XAF1-AS對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用隨著轉(zhuǎn)染質(zhì)粒劑量的增加而增強(qiáng)；在不同細(xì)胞株中(SW1116、SW480)有類(lèi)

10、似反應(yīng)； 5.熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)技術(shù)顯示XAF1能明顯抑制survivin啟動(dòng)子和TCF/catenin啟動(dòng)子活性(P<0.10)； 6.上調(diào)XAF1A蛋白的表達(dá)對(duì)腸癌細(xì)胞分化指標(biāo)E-cadherin、Villin、Pan-CEA蛋白表達(dá)無(wú)明顯的影響。 結(jié)論： 1.XAF1三種轉(zhuǎn)錄變異體在腫瘤細(xì)胞株及正常轉(zhuǎn)化細(xì)胞株中均低表達(dá)或不表達(dá)； 2.XAF1A在腫瘤中的表達(dá)與正常組織中表達(dá)無(wú)明顯差異，XA