大腸癌細(xì)胞-成纖維細(xì)胞相互作用調(diào)控大腸癌中Cx43及IGFBP7表達(dá)的研究.pdf

1、背景:結(jié)直腸癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,積極開展結(jié)直腸癌發(fā)生機(jī)制的研究對(duì)于結(jié)直腸癌的防治具有很重要的現(xiàn)實(shí)意義,腫瘤微環(huán)境對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響越來越受到人們的關(guān)注.成纖維細(xì)胞是間質(zhì)細(xì)胞中的主要細(xì)胞類型,腫瘤間質(zhì)又叫"反應(yīng)性間質(zhì)",其特點(diǎn)之一是活化的成纖維細(xì)胞增多.這些活化的成纖維細(xì)胞又叫"癌相關(guān)成纖維細(xì)胞" (cancer-associated fibroblasts, CAFs).它同時(shí)表達(dá)平滑肌細(xì)胞的標(biāo)志物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-

2、SMA)和間葉細(xì)胞的標(biāo)志物波形蛋白(vimentin).近來的研究證實(shí),正常成纖維細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞有抑制作用而CAFs反而促進(jìn)腫瘤的增殖. 縫隙連接(gapjunction)是細(xì)胞間直接相互作用的主要通道,一些小分子或水溶性的細(xì)胞代謝物、生長信號(hào)通過縫隙連接通道在相鄰細(xì)胞間流通交換從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化及調(diào)亡等生命活動(dòng),這叫做縫隙連接細(xì)胞通訊(Gap junctionalintercellular communication,GJIC)

3、.腫瘤細(xì)胞間及其與周圍正常細(xì)胞間常見縫隙連接的異常或缺失,這是腫瘤形成的一個(gè)重要原因.Cx43是縫隙連接通道蛋白的一種,因分子量43kDa而得名,在多種癌組織中低表達(dá)或缺陷. 胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7(insulin-like growth factor binding protein 7,IGFBP7)基因是我們實(shí)驗(yàn)室通過抑制性差減雜交法從結(jié)腸腺癌一正常粘膜的差減cDNA文庫中篩出的一個(gè)基因.最近本實(shí)驗(yàn)室通過體內(nèi)外研究證實(shí)它

4、可能是一個(gè)新的結(jié)直腸癌的抑癌基因.我們的研究發(fā)現(xiàn)IGFBP7蛋白在浸潤前沿的腫瘤細(xì)胞表達(dá)水平明顯高于腫瘤中心區(qū)域的腫瘤細(xì)胞,在浸潤前沿間質(zhì)的表達(dá)水平也顯著高于腫瘤中心區(qū)域的間質(zhì);現(xiàn)有的文獻(xiàn)均支持IGFBP7在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)較正常組織更高,但我們的研究卻發(fā)現(xiàn)IGFBP7在絕大多數(shù)結(jié)腸癌細(xì)胞系中表達(dá)缺失,在SW480、SW620、SW1116、HCT8、LoV0、COLO205、HT29、RKO、Caco2和Hce8693細(xì)胞中,除S

5、W480細(xì)胞和Caco2細(xì)胞外,其余均未檢測(cè)到IGFBP7mRNA的表達(dá).這種腫瘤侵襲前緣與腫瘤實(shí)體內(nèi)部的差異、體內(nèi)外的差異是否提示我們:IGFBP7的表達(dá)是否受著間質(zhì)環(huán)境的誘導(dǎo)? 目的:本研究主要著眼于大腸癌細(xì)胞與間質(zhì)成纖維細(xì)胞間的直接相互作用,通過特殊的雙層細(xì)胞球模型觀察腫瘤細(xì)胞與正常成纖維細(xì)胞問Cx43表達(dá)變化,明確兩種細(xì)胞間是否存在相互作用,以及相互作用之后腫瘤細(xì)胞IGFBP7的表達(dá)及成纖維細(xì)胞的活化狀態(tài),探討大腸癌細(xì)胞

6、.成纖維細(xì)胞相互作用在大腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用. 方法:利用本實(shí)驗(yàn)小組特制的雙層細(xì)胞球模型,將大腸癌細(xì)胞系SW620和成纖維細(xì)胞HELF培養(yǎng)成雙層細(xì)胞球,利用大腸癌細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)和雙層共培養(yǎng)作對(duì)照,通過免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)縫隙連接蛋白Cx43在大腸癌細(xì)胞一成纖維細(xì)胞混合細(xì)胞球冰凍切片中的表達(dá).采用間接免疫熒光法和RT-PCR技術(shù)分別檢測(cè)α-SMA和IGFBP7在大腸癌細(xì)胞-成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)體系中的表達(dá),觀察相互作用之后發(fā)生在兩種細(xì)胞內(nèi)

7、的改變. 結(jié)果: 1.細(xì)胞球中細(xì)胞形態(tài)良好,兩種細(xì)胞分界明顯,可連續(xù)培養(yǎng)4天. 2.在細(xì)胞球的兩種細(xì)胞交界處發(fā)現(xiàn)了明顯的Cx43表達(dá),而SW620細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)不表達(dá)Cx43,雙層共培養(yǎng)時(shí)僅有微弱表達(dá). 3.在大腸癌細(xì)胞一成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)體系中檢測(cè)IGFBP7表達(dá)發(fā)現(xiàn),將SW620細(xì)胞與成纖維細(xì)胞HELF混合共培養(yǎng)24h、48h、72h、96h均未見有IGFBP7的表達(dá),而本課題組另一部分研究已經(jīng)證實(shí)SW

8、480細(xì)胞可以誘導(dǎo)HELF中IGFBP7表達(dá).SW480細(xì)胞與SW620細(xì)胞分別來源于同一大腸癌病人的腫瘤原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶.SW480細(xì)胞本身表達(dá)IGFBP7,SW620細(xì)胞則不表達(dá).本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)證實(shí)SW620細(xì)胞不表達(dá)IGFBP7,是由于IGFBP7基因甲基化所致. 4.混合共培養(yǎng)體系中的成纖維細(xì)胞中α-SMA表達(dá)較單獨(dú)培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞明顯增高. 結(jié)論： 1.雙層細(xì)胞球是模擬體內(nèi)環(huán)境研究細(xì)胞間相互作用直觀而敏感的