大腸癌細胞-成纖維細胞相互作用調(diào)控大腸癌中Cx43及IGFBP7表達的研究.pdf

1、背景:結(jié)直腸癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,積極開展結(jié)直腸癌發(fā)生機制的研究對于結(jié)直腸癌的防治具有很重要的現(xiàn)實意義,腫瘤微環(huán)境對腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響越來越受到人們的關(guān)注.成纖維細胞是間質(zhì)細胞中的主要細胞類型,腫瘤間質(zhì)又叫"反應性間質(zhì)",其特點之一是活化的成纖維細胞增多.這些活化的成纖維細胞又叫"癌相關(guān)成纖維細胞" (cancer-associated fibroblasts, CAFs).它同時表達平滑肌細胞的標志物α-平滑肌肌動蛋白(α-

2、SMA)和間葉細胞的標志物波形蛋白(vimentin).近來的研究證實,正常成纖維細胞對腫瘤細胞有抑制作用而CAFs反而促進腫瘤的增殖. 縫隙連接(gapjunction)是細胞間直接相互作用的主要通道,一些小分子或水溶性的細胞代謝物、生長信號通過縫隙連接通道在相鄰細胞間流通交換從而調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化及調(diào)亡等生命活動,這叫做縫隙連接細胞通訊(Gap junctionalintercellular communication,GJIC)

3、.腫瘤細胞間及其與周圍正常細胞間常見縫隙連接的異常或缺失,這是腫瘤形成的一個重要原因.Cx43是縫隙連接通道蛋白的一種,因分子量43kDa而得名,在多種癌組織中低表達或缺陷. 胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7(insulin-like growth factor binding protein 7,IGFBP7)基因是我們實驗室通過抑制性差減雜交法從結(jié)腸腺癌一正常粘膜的差減cDNA文庫中篩出的一個基因.最近本實驗室通過體內(nèi)外研究證實它

4、可能是一個新的結(jié)直腸癌的抑癌基因.我們的研究發(fā)現(xiàn)IGFBP7蛋白在浸潤前沿的腫瘤細胞表達水平明顯高于腫瘤中心區(qū)域的腫瘤細胞,在浸潤前沿間質(zhì)的表達水平也顯著高于腫瘤中心區(qū)域的間質(zhì);現(xiàn)有的文獻均支持IGFBP7在結(jié)直腸癌組織中的表達較正常組織更高,但我們的研究卻發(fā)現(xiàn)IGFBP7在絕大多數(shù)結(jié)腸癌細胞系中表達缺失,在SW480、SW620、SW1116、HCT8、LoV0、COLO205、HT29、RKO、Caco2和Hce8693細胞中,除S

5、W480細胞和Caco2細胞外,其余均未檢測到IGFBP7mRNA的表達.這種腫瘤侵襲前緣與腫瘤實體內(nèi)部的差異、體內(nèi)外的差異是否提示我們:IGFBP7的表達是否受著間質(zhì)環(huán)境的誘導? 目的:本研究主要著眼于大腸癌細胞與間質(zhì)成纖維細胞間的直接相互作用,通過特殊的雙層細胞球模型觀察腫瘤細胞與正常成纖維細胞問Cx43表達變化,明確兩種細胞間是否存在相互作用,以及相互作用之后腫瘤細胞IGFBP7的表達及成纖維細胞的活化狀態(tài),探討大腸癌細胞

6、.成纖維細胞相互作用在大腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用. 方法:利用本實驗小組特制的雙層細胞球模型,將大腸癌細胞系SW620和成纖維細胞HELF培養(yǎng)成雙層細胞球,利用大腸癌細胞單獨培養(yǎng)和雙層共培養(yǎng)作對照,通過免疫細胞化學法檢測縫隙連接蛋白Cx43在大腸癌細胞一成纖維細胞混合細胞球冰凍切片中的表達.采用間接免疫熒光法和RT-PCR技術(shù)分別檢測α-SMA和IGFBP7在大腸癌細胞-成纖維細胞共培養(yǎng)體系中的表達,觀察相互作用之后發(fā)生在兩種細胞內(nèi)

7、的改變. 結(jié)果: 1.細胞球中細胞形態(tài)良好,兩種細胞分界明顯,可連續(xù)培養(yǎng)4天. 2.在細胞球的兩種細胞交界處發(fā)現(xiàn)了明顯的Cx43表達,而SW620細胞單獨培養(yǎng)時不表達Cx43,雙層共培養(yǎng)時僅有微弱表達. 3.在大腸癌細胞一成纖維細胞共培養(yǎng)體系中檢測IGFBP7表達發(fā)現(xiàn),將SW620細胞與成纖維細胞HELF混合共培養(yǎng)24h、48h、72h、96h均未見有IGFBP7的表達,而本課題組另一部分研究已經(jīng)證實SW

8、480細胞可以誘導HELF中IGFBP7表達.SW480細胞與SW620細胞分別來源于同一大腸癌病人的腫瘤原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶.SW480細胞本身表達IGFBP7,SW620細胞則不表達.本實驗室已經(jīng)證實SW620細胞不表達IGFBP7,是由于IGFBP7基因甲基化所致. 4.混合共培養(yǎng)體系中的成纖維細胞中α-SMA表達較單獨培養(yǎng)的成纖維細胞明顯增高. 結(jié)論： 1.雙層細胞球是模擬體內(nèi)環(huán)境研究細胞間相互作用直觀而敏感的