人大腸癌細(xì)胞建株的初步研究.pdf

1、本文研究目的：擬建立人大腸癌細(xì)胞株，為大腸癌的致病機(jī)制研究、提供一個(gè)良好的細(xì)胞模型。 研究方法：本實(shí)驗(yàn)分為四部分： 第一部分為腫瘤組織的體外培養(yǎng)，患者男性，年齡70，取手術(shù)切除的該患者的新鮮大腸癌組織，病理確診為直腸管狀腺癌Ⅱ級(jí)，采用組織塊培養(yǎng)法與Ⅳ膠原酶消化法做細(xì)胞原代培養(yǎng)。在含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)擴(kuò)增，穩(wěn)定傳代，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)特征和細(xì)胞生長(zhǎng)的狀況。 第二部分對(duì)所培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定

2、，包括：(1)HE染色觀察固定細(xì)胞的形態(tài)，看是否具有腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。(2)透射電鏡下(TEM)觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，從細(xì)胞內(nèi)部觀察是否符合癌組織的特點(diǎn)。(3)免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定細(xì)胞角蛋白來(lái)判斷細(xì)胞的組織來(lái)源，是否符合癌起源于上皮組織的特性。 第三部分對(duì)所培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)性狀的描述。采用MTT法繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線；流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞DNA指數(shù)，分析研究細(xì)胞的染色體倍性；并采用boyden小室觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)移力。 第四部

3、分為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，BALB/C nunu裸鼠腋背部皮下接種3×10<'6>(200ul)，4周后處死裸鼠，取出瘤組織做病理診斷，做HE染色觀察，觀察是否仍具有腫瘤的特點(diǎn)，觀察細(xì)胞的成瘤性。 研究結(jié)果： (1)大腸癌細(xì)胞在體外連續(xù)培養(yǎng)4個(gè)月，體外培養(yǎng)初步成功。 (2)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線表明，在原代培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)較慢，傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)速度加快，細(xì)胞每傳一代時(shí)間為1W。 (3)倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞呈梭形及不規(guī)則多角形，有聚

4、集生長(zhǎng)趨勢(shì)；HE染色顯示核大藍(lán)染，符合癌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征；細(xì)胞角蛋白鑒定胞漿黃染，CK陽(yáng)性，證明癌細(xì)胞起源于上皮組織；透射電鏡下，見細(xì)胞核大、細(xì)胞內(nèi)豐富的線粒體、表面微絨毛，細(xì)胞間連接復(fù)合體結(jié)構(gòu)，符合代謝旺盛的癌細(xì)胞的特點(diǎn)。流式細(xì)胞DNA倍體分析結(jié)果證明細(xì)胞為異倍體細(xì)胞，也證明了腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)；boyden小室實(shí)驗(yàn)表明此細(xì)胞具有轉(zhuǎn)移性。 (4)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，BALB/C nunu裸小鼠腋背部皮下接種三天后，可見接種部位產(chǎn)生小米粒大小

5、腫物，1W后腫物增大，隨著瘤組織的繼續(xù)增大，4W后裸小鼠精神不佳，體表溫度降低，此時(shí)測(cè)量瘤組織最終大小為2×2.5cm，瘤組織HE染色結(jié)果顯示細(xì)胞排列紊亂、失去了正常細(xì)胞所具有的接觸抑制的性質(zhì)，具有癌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。 研究結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)在體外成功進(jìn)行了人大腸癌組織來(lái)源的癌細(xì)胞的原代培養(yǎng)、穩(wěn)定傳代，并對(duì)其生物學(xué)性狀進(jìn)行了初步描述及鑒定，初步證明了此細(xì)胞來(lái)源于上皮組織，具有癌細(xì)胞的主要形態(tài)特征，此細(xì)胞具有轉(zhuǎn)移性和成瘤性的特點(diǎn)，為人大