RNAi抑制人大腸癌LOVO細胞株Bmi-1基因表達的作用及機制研究.pdf

1、目的:
　　1、篩選Bmi-1基因的RNAi表達的siRNA序列；
　　2、觀察RNA干擾（RNAi）技術(shù)沉默Bmi-1基因后對Bmi-1及其下游基因P16INK4a表達的影響；
　　3、觀察RNA干擾（RNAi）技術(shù)沉默Bmi-1基因后對人大腸癌細胞株LOVO增殖和侵襲力的影響。
　　方法：
　　1、用熒光標(biāo)記的FAM-siRNA轉(zhuǎn)染細胞并觀察轉(zhuǎn)染效率，按照lipofectamine2000說明書設(shè)置不同

2、濃度梯度的FAM-siRNA Oligo以及l(fā)ipofectamine2000的用量，將其轉(zhuǎn)染至24孔板細胞中。6小時后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，以明確優(yōu)化轉(zhuǎn)染后的最佳條件。
　　2、篩選出沉默效應(yīng)最強的的Bmi-1 siRNA序列。實驗隨機分為4組：siRNA1組、siRNA2組、siRNA3組、siRNA4組（陰性對照組）。次日，分別利用lipofectamine2000轉(zhuǎn)染至6孔板細胞中，轉(zhuǎn)染48h后提取細胞RNA。Rea

3、l-time PCR檢測細胞Bmi-1的mRNA表達水平，以篩選出沉默效應(yīng)最強的的Bmi-1 siRNA序列以及檢測Bmi-1 siRNA對細胞中Bmi-1 mRNA表達水平的影響。
　　3、Western Blot（蛋白質(zhì)印記法)檢測Bmi-1及其下游基因P16INK4a蛋白表達水平。實驗隨機分為3組：Bmi-1siRNA組（轉(zhuǎn)染篩選出的特異siRNA1），陰性對照組（轉(zhuǎn)染無特異靶基因的siRNA）、空白對照組（未轉(zhuǎn)染任何 si

4、RNA序列）。次日，分別利用lipofectamine2000轉(zhuǎn)染至6孔板細胞中，培養(yǎng)60h后提取細胞蛋白。Western Blot檢測Bmi-1及其下游基因P16INK4a蛋白表達水平。
　　4、MTT比色法檢測大腸癌細胞增殖的變化。細胞隨機分為3組：Bmi-1siRNA組（轉(zhuǎn)染篩選出的特異siRNA1），陰性對照組（轉(zhuǎn)染無特異靶基因的siRNA）、空白對照組（未轉(zhuǎn)染任何siRNA序列）。次日，分別利用lipofectamine

5、2000轉(zhuǎn)染至96孔板細胞中。于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12hs、24hs、48hs、60hs，分別在上述時段用酶標(biāo)儀在550nm波長處分別檢測Bmi-1siRNA組、陰性對照組、空白對照組的OD值，繪制其生長曲線。
　　5、Transwell小室侵襲實驗檢測大腸癌細胞侵襲力的變化。預(yù)先制備無基質(zhì)膠的Transwell小室,細胞隨機分為3組：Bmi-1siRNA組（轉(zhuǎn)染篩選出的siRNA1序列），陰性對照組（轉(zhuǎn)染無特異靶基因

6、的siRNA）、空白對照組（未轉(zhuǎn)染任何siRNA序列）。次日，分別利用lipofectamine2000轉(zhuǎn)染至6孔板細胞中。培養(yǎng)48h后用0.25%的胰酶消化細胞，以5×105個/ml細胞密度接種于預(yù)先制備的Transwell小室上室中，培養(yǎng)48h后取出Transwell小室，進行染色以及顯微鏡下細胞計數(shù)。
　　結(jié)果：
　　1、熒光標(biāo)記觀察轉(zhuǎn)染效率：在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞，同一視野下，發(fā)微弱到明亮綠色熒光的細胞均被認為是

7、轉(zhuǎn)染成功，獲得轉(zhuǎn)染效率達70%左右。說明Lipofectamine2000介導(dǎo)的化學(xué)合成的siRNA有較高的轉(zhuǎn)染效率。
　　2、mRNA相對表達量以2-ΔΔCt計算，統(tǒng)計結(jié)果顯示。Bmi-1 mRNA在siRNA1組的相對表達量明顯低于其他組，其表達抑制率為75%(P<0.05)，而在siRNA2組、siRNA3組、siRNA4組(陰性對照組)的mRNA表達無明顯差異(P<0.05)，說明siRNA1能夠抑制 Bmi-1在 mRN

8、A水平的表達。
　　3、Western blot結(jié)果示：Bmi-1/β-actine蛋白在Bmi-1siRNA組、陰性對照組、空白對照組的灰度比值分別為：0.532±0.066、1.152±0.038、1.137±0.042，顯示 Bmi-1蛋白表達在 Bmi-1siRNA組明顯低于其他組(P<0.05)，而在陰性對照組、空白對照組的蛋白表達無明顯差異(P>0.05)。P16INK4a/β-actine蛋白在 Bmi-1siRNA

9、組、陰性對照組、空白對照組的灰度比值分別為：2.186±0.137、1.772±0.088、1.717±0.099，顯示P16INK4a蛋白表達在Bmi-1siRNA組的表達高于其他組（p<0.05），而在陰性對照組、空白對照組的蛋白表達無明顯差異(P>0.05)。
　　4、LOVO細胞經(jīng)Bmi-1 siRNA轉(zhuǎn)染后，在12hs,24hs,48hs,60hs時檢測 Bmi-1 siRNA組的OD值分別是0.20±0.019(12h

10、s),0.37±0.036(24hs),0.48±0.027(48hs) and0.67±0.051(60hs)，明顯低于陰性對照組、空白對照組。從第二天（24hs）開始，Bmi-1siRNA組細胞生長速度明顯慢于陰性對照組和空白對照組，Bmi-1siRNA組的細胞增殖力與陰性對照組和空白對照組比較，有顯著差異(P<0.05),而陰性對照組與空白對照組細胞增殖力無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，說明轉(zhuǎn)染了Bmi-1 siRNA的細胞在

11、Bmi-1表達受抑制后細胞，細胞生長受到抑制，其增殖力明顯減弱，表明針對Bmi-1基因的特異性的RNAi能顯著抑制大腸癌LOVO細胞的生長。
　　5、LOVO細胞經(jīng) Bmi-1 siRNA轉(zhuǎn)染后穿過 Martrigel濾膜細胞數(shù)為（181.330±8.140）明顯少于陰性對照組(307.000±12.120)，有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。由此表明轉(zhuǎn)染針對Bmi-1 siRNA能顯著減弱大腸癌LOVO細胞侵襲力。
　　結(jié)