MicroRNA-190對人大腸癌細胞中DPC4基因轉錄后調控作用的初步研究.pdf

1、目的:利用新生血管恢復缺血組織血液供應以減少心肌損傷，恢復心功能，是治療缺血性心臟病的重要措施之一。大量研究表明，自噬和內質網應激具有心肌保護和促細胞分化作用。同時，有報道表明自噬參與缺氧誘導的血管新生過程。然而重要的血管生成誘導因子血管內皮生長因子(VEGF)介導的血管新生是否與自噬和內質網應激有關并不清楚。本研究旨在探討自噬及內質網應激在VEGF介導的人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）管型形成中的作用。為以內質網應激和自噬為靶點的血管生

2、成調控藥物的研發(fā)奠定相關理論和實驗基礎。
　　方法:以不同濃度和時間VEGF處理培養(yǎng)的HUVEC為模型，采用二氫羅丹明(DHR123)染色分析活性氧(ROS)產生，采用免疫印跡、RT-PCR技術檢測自噬及內質網應激標志物蛋白水平及mRNA水平表達，采用Matrigel分析內皮細胞管型形成能力以及細胞劃痕實驗分析細胞遷移能力。同時采用內質網應激抑制物、自噬抑制物以及自噬相關標志物基因沉默技術觀察內質網應激和自噬程度下調后對管型形成的

3、影響。以小鼠左冠狀動脈前降支結扎為心肌缺血模型，采用Westernblot檢測血管生成及自噬相關蛋白表達水平，免疫組織化學分析血管生成標志物的表達情況。
　　結果:DHR123染色定量分析顯示VEGF促進HUVEC中ROS產生，且呈現(xiàn)一定的濃度和時間依賴性關系。同時，RT-PCR和免疫印跡分析顯示:VEGF促進內質網應激相關基因肌糖需求酶-1(IRE-1)，葡萄糖調節(jié)蛋白78(GRP78/Bip)，自噬相關基因4(ATG4)，自噬

4、相關基因5（ATG5），Beclin-1(ATG6/Beclin-1) mRNA及蛋白表達，并在一定程度上呈現(xiàn)濃度及時間依賴性。利用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)及Beclin-1將異性siRNA阻斷自噬發(fā)生后能顯著抑制100 ng/ml VEGF介導的HUVEC管型形成，降低細胞遷移能力。而且阻斷自噬發(fā)生，并不影響內質網應激的發(fā)生，其相應的標志物（IRE-1，Bip）仍處于高表達狀態(tài)。利用?；切苋パ跄懰徕c(TUDC)阻斷內質網應

5、激，也同樣可以抑制VEGF介導的HUVEC形成管型的能力和細胞遷移能力，同時也抑制了自噬發(fā)生，其相應標志物LC3-Ⅱ及Beclin-1的表達下降。整體動物實驗結果顯示，心肌缺血15天后小鼠心臟組織血管生成標志物血管內皮鈣粘蛋白(VE-cadherin)表達增多，同時自噬相關蛋白LC3表達也增多。
　　結論:1.整體動物水平顯示，缺血后血管生成與LC3-(Π)兀表達呈同向變化。2.細胞水平顯示VEGF通過誘導ROS生成，引發(fā)內質網應