大腸癌中SDCBP基因功能的初步研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 大腸癌是常見的惡性腫瘤之一，近十年來，大腸癌在我國的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。轉(zhuǎn)移是影響患者治療效果和死亡的主要原因，探討與大腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的因素，尋找預(yù)防和治療的有效途徑，是當(dāng)代腫瘤學(xué)研究的一項迫切任務(wù)。SDCBP(syntenin)全名syndecanbindingprotein即多配體聚糖結(jié)合蛋白定位于8q12，全長2173bp，有9個外顯子8個內(nèi)含子，編碼298個氨基酸。SDCBP在胎兒的腎、肝、肺、

2、大腦中表達(dá)，在成人的心臟和胎盤中高表達(dá)。SDCBP蛋白包含兩個連接著的PDZ區(qū)域，通過它的兩個PDZ功能基團(tuán)可與許多細(xì)胞膜受體胞內(nèi)末端或細(xì)胞內(nèi)的信號分子結(jié)合，調(diào)控多種重要的細(xì)胞生理過程和信號傳導(dǎo)途徑，包括白介素、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的結(jié)合及活化，細(xì)胞粘著，細(xì)胞骨架形成，生長因子活化，細(xì)胞連接，細(xì)胞運(yùn)動等。SDCBP與惡性黑色素瘤、胃癌以及乳腺癌等疾病相關(guān)，在惡性黑色素瘤、胃癌以及乳腺癌中促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移及發(fā)展，大腸癌中未見報道。
　　 本

3、研究重點探討SDCBP基因?qū)Υ竽c癌增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移的影響和作用機(jī)制，闡明SDCBP在大腸癌轉(zhuǎn)移中的主要生物學(xué)功能，為大腸癌轉(zhuǎn)移的早期診斷和治療奠定理論基礎(chǔ)。
　　 研究方法：
　　 1.大腸癌組織中SDCBP的表達(dá)及臨床意義
　　 應(yīng)用免疫組化S-P法，檢測109例有十年隨防資料的大腸癌病例中SDCBP的表達(dá)，分析SDCBP的表達(dá)與大腸癌各臨床因素的關(guān)系，用Kaplan-Meier和Cox回歸分析法進(jìn)行生存分析。

4、
　　 2.SDCBP基因沉默對大腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。
　　 用RT-PCR方法檢測SDCBP基因在大腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)，篩選SDCBP表達(dá)較高的細(xì)胞株;設(shè)計并挑選有效地SDCBP基因干擾片段，進(jìn)行慢病毒包裝，將慢病毒導(dǎo)入內(nèi)源性表達(dá)SDCBP基因較高的人大腸癌HT29、SW480細(xì)胞株中，細(xì)胞流式分選穩(wěn)定細(xì)胞株，Westernblot鑒定轉(zhuǎn)染后SDCBP基因在細(xì)胞中的表達(dá);觀察SDCBP基因干擾前后，細(xì)胞增殖、體外

5、運(yùn)動遷移能力的變化。
　　 3.SDCBP基因參與大腸癌相關(guān)信號通路的初步研究。
　　 Westernblot檢測HT29、SW480大腸癌細(xì)胞株中SDCBP沉默后，PI3K/Akt和MAPK/ERK信號通路中p-AKT、AKT、p-ERK、ERK的表達(dá)變化。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.大腸癌組織中SDCBP的表達(dá)及臨床意義
　　 1.1、SDCBP與大腸癌各臨床因素之間的關(guān)系
　　 在

6、109例大腸癌組織中SDCBP的高低表達(dá)率分別為52.3％(n=57)，47.7％(n=52)，結(jié)果顯示大腸癌的年齡，性別，浸潤深度，分化程度以及組織類型與SDCBP在大腸癌組織中的表達(dá)沒有關(guān)系;而無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌中SDCBP的表達(dá)顯著低于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌(z=3.238，P=0.001)。
　　 1.2、SDCBP對大腸癌患者術(shù)后生存時間的影響
　　 為了確定SDCBP表達(dá)與大腸癌患者預(yù)后的關(guān)系，采用Kapla

7、n-Meier法描述生存曲線及Log-rank法檢驗其統(tǒng)計學(xué)意義。在隨訪期內(nèi)病例最短有效隨訪時間為七年，結(jié)果顯示在隨訪期內(nèi)SDCBP低表達(dá)組3年、5年、七年累積生存率分別為75.0±6.0(％)、69.2±6.4(％)、61.5±6.7(％);高表達(dá)組3年、5年、7年累積生存率分別為57.9±6.5(％)、45.6±6.6(％)、38.6±6.4(％);低表達(dá)組平均生存時間為86.154±6.289（月），高表達(dá)組平均生存時間為60.4

8、43±5.903（月）。其差異經(jīng)Log-rank檢驗其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=8.336，P=0.004)
　　 1.3、其他各臨床因素對大腸癌術(shù)后生存時間的影響
　　 其他各臨床因素中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況對患者術(shù)后生存時間有顯著性影響，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組平均生存時間為86.184±5.358(月)，3年、5年、7年累計生存率為78.1±5.2(％)、65.6±5.9(％)、60.9±06.1(％);有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組術(shù)后平均生存時間

9、為52.300±6.508（月）、3年、5年、7年累計生存率為48.9±0.075(％)、40.0±7.3(％)、33.3±7.0(％)。其差異經(jīng)Log—rank檢驗有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=10.585，P=0.001);而患者的性別，年齡，組織的分化，病理類型及大腸癌的浸潤深度對術(shù)后生存時間無顯著性影響。
　　 1.4、影響生存期的Cox模型多因素分析
　　 單因素分析結(jié)果顯示淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移及SDCBP的表達(dá)對患者的預(yù)后有顯

10、著影響，將這兩個因素經(jīng)多因素Cox分析發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移以及SDCBP的高表達(dá)顯著增加患者的死亡風(fēng)險(B=0.677，P=0.013;B=0.605，P=0.034)。Cox模型檢驗結(jié)果說明SDCBP的高表達(dá)及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移可以作為患者預(yù)后的獨立危險因素。
　　 2.通過RNAi技術(shù)沉默大腸癌細(xì)胞株SDCBP表達(dá)，建立SDCBP基因穩(wěn)定沉默的大腸癌細(xì)胞株
　　 2.1、驗證基因芯片結(jié)果
　　 在前期試驗中我們在大腸癌

11、細(xì)胞SW480以及其亞系SW480-SCP51，SW480-SCP58中應(yīng)用全基因組表達(dá)譜芯片篩選出差異顯著性基因SDCBP。本實驗采用熒光定量PCR檢測這三株細(xì)胞中SDCBP基因mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示在這三株細(xì)胞中SW480-SCP58中SDCBP的表達(dá)顯著低于SW480以及SW480-SCP51中的表達(dá)，經(jīng)單因素方差分析以及LSD法兩兩比較顯示其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。熒光定量檢測結(jié)果與前期基因芯片檢測結(jié)果一致。

12、>　　 2.2、大腸癌細(xì)胞株中SDCBP基因的表達(dá)
　　 應(yīng)用熒光定量PCR、Westernblot檢測6種大腸癌細(xì)胞株中SDCBP基因的表達(dá)，其結(jié)果經(jīng)單因素方差分析以及多重比較顯示SDCBP在HT29、SW480、LS174T細(xì)胞中的表達(dá)顯著升高，而在細(xì)胞HCT116、Caeo-2、SW620中則顯著降低(P＜0.05)。
　　 2.3、穩(wěn)定干擾細(xì)胞株的建立
　　 構(gòu)建了四個干擾SDCBP基因表達(dá)的干擾片段以

13、及陰性對照片段5’-AATTCTCCGAACGTGTCACGT-3'，將干擾片段分別轉(zhuǎn)染HT29細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)5'-GCAAGACCTTCCAGTATAA-3'干擾片段干擾效率最高。將干擾片段以及陰性對照片段分別進(jìn)行慢病毒包裝。將包裝產(chǎn)生的兩種慢病毒（實驗組命名為Lentivirus-shRNA-SDCBP，對照組命名為Lentivirus-shRNA-NC）分別感染HT29、SW480細(xì)胞株。流式細(xì)胞儀分別分選出GFP+的細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)

14、。分別命名為HT29-SDCBP(-)、HT29-NC、SW480-SDCBP(-)、SW480-NC。細(xì)胞培養(yǎng)傳代一個月后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測GFP+細(xì)胞比例均達(dá)到95％以上，westernblot檢測SDCBP蛋白的表達(dá)量，經(jīng)檢測HT29-SDCBP(-)、SW480-SDCBP(-)細(xì)胞株中SDCBP的蛋白表達(dá)量顯著低于HT29-NC、SW480-NC細(xì)胞株。
　　 3.SDCBP沉默對大腸癌細(xì)胞株HT29、SW480細(xì)胞生物

15、學(xué)特性的影響
　　 3.1、SDCBP沉默對大腸癌細(xì)胞株HT29、SW480細(xì)胞周期的影響。
　　 采用流式細(xì)胞儀的方法分別分析HT29-NC、HT29-SDCBP(-)兩組細(xì)胞以及SW480-NC、SW480-SDCBP(-)兩組細(xì)胞的細(xì)胞周期分布。實驗結(jié)果表明，HT29-NC、HT29-SDCBP(-)兩組細(xì)胞的細(xì)胞增殖率(合成期S+合成后期G2/分裂期M)分別為37.4067％和27.7000％，SDCBP基因沉默

16、組HT29-SDCBP(-)與對照組HT29-NC相比，細(xì)胞的增殖率顯著降低，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=12.006;P=0.000);在SW480-NC、SW480-SDCBP(-)兩種細(xì)胞的細(xì)胞增殖率（合成期S+合成后期G2/分裂期M）分別為41.5767％和30.4000％，SDCBP基因沉默組SW480-SDCBP(-)與對照組SW480-NC相比，細(xì)胞的增殖率顯著性降低，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=12.347;P=0.000)

17、。說明SDCBP基因的干擾抑制HT29、SW480細(xì)胞的增殖速度。
　　 3.2、平板克隆實驗檢測SDCBP的沉默對細(xì)胞克隆形成能力的影響
　　 HT29-NC、HT29-SDCBP(-)兩組細(xì)胞以及SW480-NC、SW480-SDCBP(-)兩組細(xì)胞均能在平板中形成克隆，HT29-NC、HT29-SDCBP(-)兩組細(xì)胞克隆形成率分別為73.5000±5.56776(％)和67.8333±4.53689(％)，采用兩

18、獨立樣本t檢驗分析發(fā)現(xiàn)兩組細(xì)胞的克隆形成能力不具有顯著性差異(t=1.367，P=0.246);SW480-NC、SW480-SDCBP(-)組細(xì)胞的克隆形成率分別為45.3333±4.01040(％)和40.6667±4.36845(％)，采用兩獨立樣本t檢驗分析發(fā)現(xiàn)兩組細(xì)胞的克隆形成能力不具有顯著性差異(t=1.363，P=0.245);提示SDCBP基因沉默后，大腸癌細(xì)胞單個細(xì)胞的生長增殖形成克隆的能力沒有顯著性變化。
　　

19、 3.3、CCK8細(xì)胞活性檢測試驗檢測細(xì)胞增殖能力。
　　 采用CCK8細(xì)胞活性檢測試驗檢測SDCBP抑制后細(xì)胞增殖能力的變化，并繪制生長曲線。析因方差分析結(jié)果顯示，HT29細(xì)胞株中兩組間細(xì)胞增殖能力差異明顯(F=1242.374，P＜0.001)，兩個組別生長時間水平差異具有顯著性(F=4357.636，P＜0.001)，時間與分組之間交互效應(yīng)顯著(F=141.215，P＜0.001);SW480細(xì)胞株中兩組間細(xì)胞增殖能力差

20、異明顯(F=1496.071，P＜0.001)，兩個組別生長時間水平差異具有顯著性(F=3851.319，P＜0.001)，時間與分組之間交互效應(yīng)顯著(F=198.515，P＜0.001);從兩株細(xì)胞的增長曲線以及統(tǒng)計分析結(jié)果說明抑制SDCBP能夠抑制大腸癌細(xì)胞HT29，SW480的體外增殖能力。
　　 3.4、運(yùn)動小室實驗檢測SDCBP的抑制對HT29、SW480細(xì)胞運(yùn)動遷移能力的影響。
　　 采用Transwell小

21、室的方法檢測SDCBP抑制后細(xì)胞體外遷移運(yùn)動能力的變化，通過各組細(xì)胞穿過人工基底膜細(xì)胞數(shù)量的多少來評估各組細(xì)胞遷移運(yùn)動的能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HT29-NC、HT29-SDCBP(-)兩組細(xì)胞穿過基底膜的數(shù)量分別為19.67±2.517、15.67-2.082，沒有顯著性差異（t=2.121，P=0.101）;SW480-NC、SW480-SDCBP(-)兩組細(xì)胞穿過基底膜的數(shù)量分別為136.33±8.505、93.33±11.676，其差異具

22、有顯著性(t=5.156，P=0.007)。此結(jié)果表明SDCBP基因的沉默對大腸癌HT29細(xì)胞體外的運(yùn)動遷移能力有所抑制，但其影響并不顯著;而在大腸癌細(xì)胞SW480中SW480-SDCBP(-)其運(yùn)動能力較SW480-NC明顯降低，說明SDCBP基因的沉默能夠抑制SW480細(xì)胞的遷移運(yùn)動能力。
　　 4.SDCBP相關(guān)信號通路的檢測
　　 SDCBP基因的沉默對大腸癌細(xì)胞HT29、SW480中PI3K/Akt及MAPK/

23、ERK信號通路蛋白AKT、ERK2、p-AKT、p-ERK表達(dá)的影響。利用Westernblot檢測HT29-NC、HT29-SDCBP(-)兩組細(xì)胞以及SW480-NC、SW480-SDCBP(-)兩組細(xì)胞中AKT、ERK2、p-AKT、p-ERK的表達(dá)，結(jié)果顯示p-AKT和p-ERK在HT29-SDCBP(-)組細(xì)胞中的表達(dá)比HT29-NC組降低，而AKT和ERK2總蛋白量在2組間無明顯差異;p-AKT和p-ERK在SW480-SD